Introducción

La investigación de estos dos agentes zoonóticos es de gran ayuda para interpretar lo que está sucediendo en los animales de producción, identificar que cepas circulan, haciendo un relevamiento en bovinos y porcinos.

La leptospirosis es una enfermedad infecto-contagiosa, causada por una bacteria del género Leptospira spp que afecta sobre todo a los animales domésticos, los que sirven como fuente de infección para el hombre. Presenta una epidemiología compleja y distribución cosmopolita, en la que varias especies, actúan como huéspedes de mantenimiento de muchas serovariedades en todo el mundo, siendo el hombre y los animales de explotación huéspedes accidentales .

Es la zoonosis de mayor distribución mundial. Algunas prácticas laborales, como el trabajo en agricultura y ganadería (veterinarios, ganaderos, trabajadores de mataderos), así como ciertas actividades recreativas que implican contacto con aguas posiblemente contaminadas, suponen los riesgos de contagio más importantes. La leptospirosis es un serio problema en las explotaciones ganaderas por las pérdidas que ocasiona, y por las implicancias en la salud pública .

Las prevalencias y tasas de incidencias publicadas para esta enfermedad en el mundo varían notablemente según la zona y pueden llegar a alcanzar valores elevados en tiempos de inundaciones. La República Argentina es un país endémico con brotes epidémicos en períodos lluviosos.

La OMS ha estimado una tasa de incidencia en humanos entre 4-100 casos por 100.000 habitantes en países latinoamericanos. En la ganadería y en la producción porcina, su importancia radica en las pérdidas que produce por los fallos reproductivos donde pueden aparecer natimortos, abortos y/o nacimientos de animales débiles e infertilidad. Resulta difícil estimar las pérdidas por este concepto, en gran parte por las dificultades inherentes al diagnóstico de la enfermedad.

El 5 a 10 % de los abortos en bovinos son debidos a leptospirosis. Y el 5-6 % de los abortos porcinos pueden ser por leptospirosis. Podemos estimar que la pérdida por aborto está entre 500 y 1000 U$S. La mayoría de los abortos en el ganado se presentan en el último tercio de la gestación y alrededor de las 6-12 semanas posteriores a la leptospiremia inicial. Con la entrada de la infección en el animal sin experiencia inmunitaria previa, podría esperarse hasta un 30 % de abortos, mientras que en un animal donde la infección ha estado ya presente, los abortos pueden afectar al 5 % a 10 %. Debemos tener en cuenta también el riesgo que representan los animales de compañía, los caninos son una fuente muy importante de diseminación de leptospiras, como hemos expuesto en los estudios anteriores.

Brucelosis es una enfermedad infecciosa producida por bacterias del género Brucella, que ataca a varias especies de mamíferos, dentro de los cuales se encuentra el hombre, en el cual produce un cuadro febril inespecífico. Tiene distribución mundial y afecta principalmente a personas que trabajan con animales o productos infectados.

Entre los mamíferos que pueden contraer la enfermedad se cuentan algunos que tienen una alta relevancia económica, como el ganado bovino, equino, porcino, ovino y caprino, así como también algunas otras especies silvestres.

B. melitensis es la especie más difundida seguida de B. abortus y B. suis. Los animales infectados excretan gran cantidad de bacterias en los tejidos de abortos, en la leche, y también en las secreciones genitales, contaminando el suelo, los corrales, la paja de las camas, el agua de arroyos, canales y pozos. La Brucella spp es capaz de sobrevivir en el medio ambiente por períodos relativamente largos. En las heces hasta 100 días, en la tierra del suelo hasta 80 días y en ambientes helados su sobrevida puede prolongarse por meses.

Esta zoonosis se transmite al hombre por contacto directo con los animales infectados, sus excretas, o en el ambiente donde ha sobrevivido la Brucella. La transmisión persona a persona es muy rara y puede ser por vía sexual.

Por la vía oral las bacterias pasan al aparato digestivo, siendo la fuente principal de esta vía de infección la ingestión de leche no pasteurizada o de productos lácteos, especialmente los provenientes de ovejas y cabras.

Brucelosis representa un serio problema de salud pública, provocando pérdidas económicas por los abortos que produce en los animales de producción.

Por todo esto nuestro objetivo fue realizar un estudio epidemiológico de leptospirosis y brucelosis mediantes técnicas diagnósticas serológicas para ambas zoonosis; y técnicas  bacteriológicas y de genotipificación para leptospirosis.

Materiales y Metodología

Leptospirosis: 

Se realizaron pruebas referenciales (MAT) ,y de screening (ELISA y TR) para leptospirosis

Se enfrentaron los  sueros con nueve antígenos de serovariedades referenciales para nuestro país con la técnica de microaglutinación ( MAT) y con 2 técnicas de screening , un test de ELISA; y  una prueba macroscópica género específica desarrollada con cepas Canicola Hond Utrecht IV, Icterohaemorrhagiae M20 y Pomona Pomona.

Pruebas de screening: para el test de ELISA se probaron dos antígenos, uno termotratado de Leptospira interrogans serovar Pomona (TIR) y una lipoproteína recombinante rLipL32 (LIPI).

Las placas Nunc fueron sensibilizadas con 200 ul/well de cada antígeno en buffer bicarbonato pH 9.6 durante la noche a temperatura ambiente. Los antígenos se usaron a una dilución 1/800, previa titulación.  Posteriomente  se colocaron 200 ul de suero bovino en una dilución 1/200 en PBS-Tween 20 al 0.5% y leche descremada al 3% (buffer de bloqueo) y se incubó la placa 1h a 37^oC.  Luego de lavar con buffer de lavado (PBS-Tween 20 pH 7.2) se agregó el conjugado antiespecie bovino 1/1000, en buffer de bloqueo marcado con peroxidasa, incubándose 1h a 37^oC.

Previo lavado se reveló con ABTS  4mM en buffer citrato pH 5, 0.05M y 3% de peróxido de hidrógeno. Se hizo una lectura a los 15 min a 405 nm.

Se usó el Program  MedCal y ROC para la lectura de los resultados. El punto de corte para los dos antígenos fue determinado por medio de la curva ROC, siendo de 0.32 para ambas pruebas.

La prueba macroscópica género específica (TR)  fue desarrollada con cepas Canicola Hond Utrecht IV, Icterohaemorrhagiae M20 y Pomona Pomona.

El tamaño de la muestra es de 1200 sueros, correspondiendo 500 a bovinos y 700 a porcinos. En los casos de aborto, muerte de terneros o animales de recría se procesaron órganos y líquidos biológicos en medio semisólido de cultivo Fletcher y medio líquido EMJH para aislar leptospiras.

A los aislamientos logrados posteriormente se les determinaron los perfiles genéticos, para conocer las cepas circulantes. Para ello se utilizó la técnica Múltiple-Locus Variable- number tandem repeat Análisis (MLVA) para tipificación molecular de las cepas, técnica molecular que hemos puesto a punto, con partidores que flanquean a los loci de VNTR4, VNTR7, VNTR9, VNTR10, VNTR19, VNTR23 y VNTR31. Teniendo en cuenta el número de repeticiones de pares de bases obtenidas en cada cepa tipificada con la metodología propuesta, se pudo conocer los genotipos circulantes. Se analizó el patrón de bandas y se calcularon las copias, utilizando el programa UPGM.

Brucelosis

Se están aplicando las técnicas BPA y FPA en los sueros como screening para un rápido diagnóstico que nos permitirá detectar los animales positivos.

Se analizaron con las técnicas BPA y FPA  500 sueros bovinos, el resto de los sueros  bovinos, y los sueros porcinos se están procesando y se completarán a lo largo del año 2015.

Muestras Leptospirosis

Sueros: bovinos (500) y porcinos (700)

Orina: La muestra de orina se observó al microscopio para tratar de detectar leptospiras, sembramos asépticamente (pasaje por filtros de 0.22 µm) en el primero de una serie de cuatro tubos de medio de cultivo, 1ml de orina. A continuación realizamos diluciones 1/10 en los tubos siguientes. El objetivo fue eliminar por dilución, el efecto inhibidor sobre el crecimiento que tiene la orina.

Órganos: Se tomaron trozos de órgano y se quemó la superficie con una espátula metálica caliente. Se sacó un trocito del mismo con pipeta Pasteur o aguja de biopsia. Esta muestra de órgano luego fue sembrada asépticamente en un tubo con medio de cultivo .Se cortaron trocitos de los órganos (hígado,riñón,bazo) se los flameó y se los introdujo asépticamente en una jeringa de 10ml estéril. Luego se forzó el paso de este material a través del pico de la jeringa hacia un tubo con medio de cultivo y se lo dejó reposar de 30 a 60 minutos. En todos los casos, los tubos con medio de cultivo sembrados fueron incubados a 28ºC y revisados semanalmente al microscopio de campo oscuro para observar el desarrollo de leptospiras. Se eliminaron los cultivos negativos a los seis meses del sembrado.

Resultados

Leptospirosis

-Determinamos las serovariedades circulantes de Leptospira spp en bovinos y porcinos

- Aislamos leptospiras a partir de órganos de casos clínicos bovinos y porcinos

-Determinamos el perfil genético de las cepas circulantes mediante la técnica molecular de Multiple locus variable tándem repeats

-Realizamos estudios serológicos específicos para detectar anticuerpos contra leptospirosis

Con la técnica de Microaglutinación para Leptospira, analizamos serológicamente a 1200 animales incluídos en este estudio y tomamos conocimiento de las serovariedades circulantes.

Bovinos: 38 % de seropositividad a Leptospira interrogans serovar Pomona Pomona, Leptospira interrogans serovar Hardjo Hardjoprajitno, Leptospira interrogans serovar Wolfii 3705

Porcinos: 22 % de seropositividad a :Leptospira interrogans serovar Pomona, Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae.

Técnicas de screening: El ELISA desarrollado con el antígeno TIR dió una sensibilidad de 83.3% y una especificidad de 94.9 % y el desarrollado con el antígeno LIPI  una sensibilidad del 80.0% y una especificidad de 95.0 %, no observándose diferencias significativas entre ambos ELISAs en sueros bovinos.

La técnica de aglutinación macroscópica (TR) mostró una concordancia de 80 % en los sueros bovinos y 100 % en los sueros caninos.

-Aislamientos: Se procesaron 76 órganos, hígado, riñón y bazo de bovinos y 28 orinas de porcinos. Aislamos leptospiras en hígado y riñón de bovino, y en orina de porcino. Se aisló en bovinos Leptospira interrogans serovar Pomona Pomona.

Y en porcinos Leptospira interrogansserovar Icterohaemorrhagiae RGA.

-Se están analizando los resultados serológicos de brucelosis, de 1200 sueros (500 bovinos y 700 porcinos).

Brucelosis

Se procesaron 500 sueros de bovinos con las técnicas FPA y BPA.

De los sueros analizados, el 38 % fue positivo a BPA, y fueron confirmados como positivos mediante FPA el 68 %.

Producción Científica

- Felipe Da Silva, Sylvia Grune, Bibiana Brihuega.(2014). Serological findings and isolation ofLeptospira interrogans serovar Pomona in rural area of Maranhao, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo.

-Brihuega B., Martinez M., Romero G., Grune S.( 2013). Leptospirosis in subsitence production of small rumiants. Rev.Arg.Zoon y Enf Inf. Emerg. Vol VIII, 2.: 38.

- Mara Martínez, Sylvia Grune Loffler, Luis Samartino, Graciela Romero, Ignacio De la Fuente y Bibiana Brihuega (2014). "Detección de leptospiras patógenas mediante PCR usando los iniciadores LigBF y LigBR". Rev Argentina de Zoonosis y Enfermedades Emergentes. Vol. IX Nº 2. junio 2014.

- Sylvia Grune, Mara Martínez, Luis Samartino, Graciela Romero, Bibiana Brihuega (2014). Coincidencia de perfiles genéticos de Leptospira borgpetersenii en animales silvestres y domésticos en Argentina. Aceptado para su publicación  en la Revista Argentina de Zoonosis y Enfermedades Emergentes.

5-Ignacio Gamietea, Mara Martínez, Sylvia Grune, Graciela Romero, Bibiana Brihuega (2014). "Datos preliminares sobre serovares de Leptospira spp. predominantes en bovinos de la región insular del partido de Campana, delta inferior bonaerense del río Paraná, Argentina." Aceptado para su publicación en la Revista Argentina de Zoonosis y Enfermedades Emergentes.

-Grune Loffler S, Pavan ME, Vanasco B, Samartino L, Suarez O, Auteri C, Romero G, Brihuega B.(2014). Genotypes of pathogenic Leptospira spp isolated from rodents in Argentina.Mem Inst Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro: 1-5, 2014

-Mara Martínez, Sylvia Grune Loffler, Luis Samartino, Graciela Romero, Ignacio De la Fuente y Bibiana Brihuega (2014). Estudio serológico de leptospirosis porcina en la llanura pampeana de la República Argentina. Aceptado para su publicación en la Revista Argentina de Zoonosis y Enfermedades Emergentes.

-A. Martínez, J. Binca, B. Brihuega, M. Sheridan, M. Mozgovoj, V. Parreño, M.L. Gosi, C. A. Robles.2013. Relevamiento sanitario en caprinos en una zona de peri-valle de la provincia de Río Negro, Argentina. Vet. Arg.  Vol. X -Nº303 - Julio 2013

- P. E. Martino,N. O. Stanchi, M. Silvestrini, B. Brihuega, L. Samartino,E. Parrado.(2014).Seroprevalence for selected pathogens of zoonotic importance in wild nutria (Myocastor coypus). Eur J Wildl Res .March 2014. DOI 10.1007/s10344-014-0805-4

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-Ana Cecilia Gozzi, M. Laura Guichón Verónica Victoria Benitez, Graciela Noemi Romero, Carmelo Auteri& Bibiana Brihuega. (2013). First isolation of Leptospira interrogans from the arboreal squirrel Callosciurus erythraeus introduced in Argentina.Wildlife Biology, 19(4):483-489.2013. 

- Juan Micheloud, Mara M Martínez, Grune Sylvia, Sofia G Zurita, Graciela Romero, Bibiana Brihuega (2014) Aborto en caballos por leptospiras en Salta, Argentina. Aceptado para su publicación en Revista Argentina de Microbiología

-Scialfa E, Giampretti S, Brihuega B, Grune S, Aguirre P, Gallicchio O. 2013.Leptospirosis en animales sinantrópicos capturados en áreas periurbanas de la ciudad de Azul, Provincia de Buenos Aires. Revista de Infectología  D. Francisco J. Muñiz, Buenos Aires, 2013; 16 (1): 32.