Investigadores

Resumen

Diaz Pumara, Patricio Z.
Iorio, Gabriel
Vazquez-Levin, M.
Rafaelli, Paula Mariana
Rosales, Juan
Nuñez, Mercedes

Introducción- Objetivos

Producción de proteínas de interés farmacológico en fracción proteica de la leche ovina en ovinos genéticamente modificados (OGM) mediante aplicación combinada de las técnicas de Fertilización In-Vitro (FIV) Inseminación Artificial (IA) y Transferencia de Genes por Medio de Espermatozoides (SMGT) según ha sido desarrollado por otros grupos. Basados en los avances realizados en la técnica de FIV y en la técnica de siembra laparoscópica de embriones, el grupo de trabajo integrado por veterinarios y biólogos moleculares desarrollará la incorporación de genes exógenos mediante la técnica (SMGT) Se realizaran controles de expresión de genes en las diferentes etapas del desarrollo embrionario y adulto y se espera obtener expresión de proteínas heterólogas en la fracción proteica de la leche. 

Avance

Durante el período de referencia (2013-2014) continuando con los trabajos informados en el avance anterior se realizaron ensayos de co-incubación con diferentes concentraciones de construcciones plasmídicas por millón de espermatozoides por periodos variables de tiempo, en condiciones físico-químicas también variables con el objetivo de precisar el método de mejores resultados en cuanto a  la incorporación de las mismos al espermatozoide (SPZ). La evaluación fue hecha en base a la observación y registro microfotográfico bajo microscopia de microdisección de captura láser (LCM) con iluminación epi-fluorescente con cubo de filtro adecuado a la señal emitida por el fluoróforo de muestras fijadas y montadas sobre portaobjetos. Los resultados fueron considerados satisfactorios cuando el porcentaje de incorporación del eDNA supera el 90% de las células espermáticas expuestas por campo visual.

El trabajo anterior, alcanzados los objetivos planteados, fue sucedido por el intento de generar embriones ovinos por FIV de acuerdo a los parámetros establecidos en nuestro laboratorio con semen acondicionado según los resultados obtenidos en los ensayos previos. Para esto se utilizaron 48 Complejos Cumulus Ovocito (CCOs)  provenientes de 35 tractos genitales ovinos de matadero, cultivados y madurados in-vitro según se a descripto anteriormente. Dos muestras, una tratada con semen co-incubado y la otra (control) con semen no co-incubado son puestas a fertilizar. Luego de la fertilización y cultivo los embriones son retirados y observados bajo microscopia LCM y confocal de fluorescencia. Si bien la muestra control debió ser descartada por excesiva fibrinosis al momento de la observación en la muestra tratada pudo observarse 11 blastocistos expandidos con intensa señal de fluorescencia en todas las blastómeros, 6 ovocitos no fertilizados y 4 embriones malformados no presentaron señal bajo luz fluorescente. Se consideró que, si bien hubo que descartar la muestra control,  el hecho que aquellos no fertilizados no presentaron fluorescencia alguna al ser iluminados con la frecuencia de onda estipulada resultó hecho válido como para demostrar la transfección realizada por parte del SPZ. Ambas actividades fueron motivo de elaboración y publicación de resúmenes en congresos de la especialidad uno en la XXVIIIª Reunión Anual de la Sociedad Brasilera de Tecnología de Embriones entre el 14 y 17 de Agosto del 2014 en Natal RN Brasil y otro en el II Simposio de Reproducción Animal organizado por la Facultad de Ciencias Veterinaria de Chile en Santiago, Chile para el 13 y 14 de Noviembre del 2014.

El paso siguiente fue preparar los ensayos previstos sobre animales in-vivo por IA con semen tratado. Dado el equipamiento quirúrgico necesario se integró un convenio con el Bioterio de Investigaciones Médicas del Hospital Nacional Profesor Posadas. Fueron seleccionadas 4 ovejas de cuatro a seis dientes de edad con buenos antecedentes de fertilidad y sanidad. Fueron sincronizadas y superovuladas para ser inseminadas laparoscopicamente, tres de ellas  con semen co-incubado con dos plásmidos (Cy3 y pEGFP) de acuerdo a lo descripto anteriormente, la restante (control) fue inseminada con semen no tratado. Siete días más tarde se realiza lavaje intra-uterino (también vía laparoscópica) para colecta de los embriones. La respuesta superovulatoria fue buena en todas las ovejas, no obstante, solo una de ellas ovuló de acuerdo a lo esperado; el resto, incluida la oveja control, tuvo celo anovulatorio, y como consecuencia no se obtuvieron ni embriones ni ovocitos.  De la oveja que evidenció signos ovulatorios (léase presencia de cuerpos lúteos de tamaño acorde) se obtuvieron 9 ovocitos tres de los cuales resultaron fertilizados.

Los seis ovocitos no fertilizados y los tres embriones fueron fijados y montados para su observación bajo microscopía LCM y confocal de fluorescencia, al igual que los anteriores en los laboratorios  y con el equipamiento del Instituto de Biología y Medicina Experimental. Los resultados son registrados con microfotografias. Los tres embriones con diferente grado de desarrollo evidenciaron fluorescencia en todas las blastómeras, tanto para la fluorescencia roja (Cy3) como la verde (GFP) considerados entonces multi-transgénicos. Nuevamente pudo constatarse que si bien el animal preparado como control no aportó embriones, los ovocitos no fertilizados de la oveja con respuesta ovulatoria, no evidenciaron fluorescencia alguna iluminadas con la misma frecuencia de onda que los fertilizados. Esto nos permite deducir que la transfección fue realizada por parte del SPZ durante el proceso de fertilización de acuerdo a lo esperado tanto del plásmido de señal roja como el de señal verde.

Tanto los ensayos de FIV como de IA  con semen co-incubado con el objetivo de aumentar la casuística y confirmar los resultados en base a estudios analíticos de identificación del/los transgen/es en el genoma huésped. Se prevé también comenzar con construcciones plasmídicas "no reporter"  como se llama usualmente a las fluorescentes.

Durante el desarrollo de este trabajo dos alumnos regulares de la materia cursaron parte de su práctica final orientada y participan como autores en las publicaciones citadas (Beliera, Valeria - Lopez Sigón, Rocío)

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Palabras claves: 

Modificación gentética

Fertilización in vitro

SMGT Sperm

OGM Organismos Genéticamente Modificados

FIV Fertilización In Vitro