Investigadores

Resumen

Romera, Sonia Alejandra
Maidana, Silvina

"Rol del búfalo de agua (Bubalus bubalis) como reservorio de virus endémicos de bovinos"

 Resumen

En la República Argentina, la explotación ganadera ocupa un lugar preponderante de la economía nacional. Gran porcentaje de las pérdidas que tienen lugar en la ganadería son debidas a la incidencia de enfermedades infecciosas ya sea de origen viral, bacteriano, o parasitario. Dentro de las enfermedades que causan grandes pérdidas económicas en la industria ganadera se encuentra las del complejo respiratorio bovino (CRB), conformado por Herpesvirus bovino 1, el virus de la Diarrea viral bovina, virus Sincicial Respiratorio bovino y Parainfluenza 3, y bacterias, Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, Pasteurella multocida y Haemophillus somnus que junto con otros factores generan un estado de compromiso inmunitario en el bovino desencadenando signos respiratorios serios. En las últimas décadas se inició una intensa búsqueda de nuevas alternativas de producción de carnes. Nuestro país se interiorizó en la producción, entre otros, de búfalos. Dado que los sistemas de producción han evolucionado a sistemas mixtos, es importante establecer la identidad de los distintos agentes que circulan en los animales que conviven en un mismo ambiente, tanto los propios de la especie como aquellos que logran superar la barrera interespecie ya que pueden transmitirse enfermedades, transformándose en reservorios con impacto tanto en la epidemiologia de las distintas enfermedades en la población de origen así como en las otras poblaciones que cohabitan. Un caso particular de estas producciones mixtas son las de bovinos y búfalos. Esta última se ha incrementado notablemente en la última década ascendiendo a mas de 120000 mil cabezas en el 2012. Estudios serológicos por nosotros realizados en búfalos en el noreste de nuestro país, indicaron la circulación de virus respiratorios endémicos. Recientemente hemos aislado un virus PI3 de un brote clínico de enfermedad respiratoria en búfalos de un rodeo mixto tambero (bovinos y búfalos) del Chaco. Por otro lado en este período hemos aislado herpesvirus caracterizandose, como herpesvirus bubalino (BuHV-1). Si bien existen en el mundo datos de serología positiva a virus respiratorios sólo se han reportado unos pocos aislamientos y en estos trabajos solo fueron caracterizados con técnicas clásicas de virología. Surge entonces la necesidad de aislar y caracterizar los virus respiratorios de rodeos bubalinos y los que puedan cocircular en rodeos mixtos de nuestro país evaluando la existencia de variantes genéticas productos de mutaciones fijadas en la adaptación al nuevo hospedador luego de un salto interespecie. Teniendo en cuenta los antecedentes mencionados, en este proyecto se plantea como objetivo general la caracterización de los virus respiratorios que afectan el búfalo de agua evaluando principalmente su rol como reservorio de virus endémicos de importancia para la producción bovina.

Fundamentación

En nuestro país, la explotación ganadera es un sector importante dentro de la economía nacional. Las enfermedades infecciosas ya sea de origen viral, bacteriano, o parasitario ocasionan grandes pérdidas económicas. Estas enfermedades originan pérdidas económicas directas, cuantificables a nivel de la producción de carne y de leche, o bien pérdidas económicas indirectas cuantificables a nivel de las restricciones a la comercialización, tanto en el mercado nacional como en el internacional, afectando la posibilidad de exportar a los mercados más importantes que imponen barreras sanitarias y para-arancelarias para productos originados en países con circulación de determinados agentes patógenos, previstas en el Código Internacional de Salud Animal estimulando así en nuestro país la ejecución de programas de control y  erradicación de enfermedades que afectan a la producción bovina. Para que estos programas sean eficientes hay que conocer que función cumplen los reservorios de estas enfermedades en la epidemiología del ganado bovino. Dentro de las enfermedades que causan pérdidas económicas para la industria ganadera en nuestro país se encuentran los virus respiratorios endémicos como por ejemplo la rinotracheitis infecciosa bovina (IBR),  la diarrea viral bovina (BVD), virus parainfluenza 3 (BPI3) y virus  sincitial bovino (VRSB). Todas ellas se presentan con un alto porcentaje de morbilidad y baja letalidad, con una marcada pérdida de productividad. En el caso de IBR y BVD las principales consecuencias son los bajos índices de preñez, al actuar durante el servicio o producir abortos en la gestación. El BRSV y el BPI3 están involucrados en los cuadros de "Neumonía Enzootica", que afecta principalmente la de ganancia de peso diaria de un animal.

Las producciones de búfalo, ñandú, choique, emú, guanaco, llama y ciervo han comenzado a consolidar espacios que apuestan a potenciar la oferta de productos de alta calidad que la Argentina puede ofrecer al mundo.  Debido a esto, los sistemas de producción han evolucionado a sistemas mixtos, en donde especies de producción alternativa conviven en un mismo hábitat con los bovinos. Particularmente en el caso del búfalo, se ha demostrado que esta especie es susceptible a infecciones tanto bacterianas (Guanziroli S, 2006; Martines D, 2006) como virales. Dentro de las virales, De Carlo y col. en el 2004 reactivaron herpesvirus por inmunosupresión en búfalos del sur de Italia. En india un estudio arrojó una seroprevalencia del 52.5% contra BoHV-1 en búfalos (Renukaradhya GJ, 1996).  También se aisló PI3 de búfalos africanos (Hablim C, 1980) y se detectó BVDV en fetos de búfalos abortados del sur de Italia (Martuchello A, 2009).  

Ya se ha demostrado la circulación de diferentes agentes virales en búfalos de otras partes del mundo por lo que es de fundamental importancia establecer la identidad de los distintos agentes que circulan en los búfalos de agua de nuestro país. En este contexto es importante evaluar la sanidad de éstos nuevos sistemas mixtos de producción, caracterizar los virus circulantes  y determinar el rol del búfalo como reservorio de infecciones endémicas de los bovinos.

HIPÓTESIS

El búfalo de agua (Bubalus bubalis sp.) es susceptible a virus respiratorios y actúa como reservorio de virus endémicos respiratorios de importancia económica en la producción bovina.

OBJETIVOS

General

Evaluar la circulación de virus respiratorios de importancia económica para la producción bovina en búfalos de agua (Bubalus bubalis sp.) mediante serología y aislamiento viral.

Particulares

- Determinar la seroprevalencia de los virus en estudio en bovinos y búfalos de agua.

- Detección de virus en muestras de bovinos y  búfalos.

- Caracterización y comparación de los aislamientos virales Argentinos circulando en el rodeo bovino con los circulantes en el rodeo bubalino y con los circulantes en el mundo.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR

a)    Planificación y ejecución de muestreos en distintas regiones del país

b)    Estandarización de técnicas serológicas y de biología molecular para determinaciones de virus respiratorios en muestras de búfalos y bovinos.

c)     Evaluación de las muestras:

            o    Determinación serológica

            o    Detección de virus 

d)    Caracterización y comparación de los agentes virales respiratorios en ambos rodeos argentinos y con los circulantes en el mundo.

 Acciones realizadas hasta el momento

RESULTADOS

 a)    Planificación y ejecución de muestreos en distintas regiones del país

En este período se contactaron productores de campos de cría de búfalos de la provincia de Buenos Aires ampliando el muestreo. Se muestrearon 3 campos tomando muestras de 100 búfalos cada uno

b)    Estandarización de técnicas serológicas y de biología molecular para determinaciones de virus respiratorios en muestras de búfalos y bovinos obtenidos a campo.

Estandarización de PCR multiplex  REA para subtipificación de BoHV5

            Para ampliar y mejorar la subtipificación de los BoHV5 se diseñó una PCR multiplex REA basado en una PCR REA previamente desarrollada. El ensayo de PCR REA que amplifica un fragmento de 534 pb que incluye una mutación puntual que cambia el sitio de restricción de la enzima BstEII y por lo tanto es responsable de la clasificación de BoHV5 "a" y "b". Primeramente estudiamos en que parte del genoma se localizaba el sitio de restricción mutado, para ello utilizamos el programa Vector NTI Suite versión 8.0 (InforMax Inc-Invitrogen, Merelbeke, Belgium). Luego se diseñó un par de cebadores que amplifican la zona de ese sitio de restricción (534 pb). Para el ensayo multiplex REA se tomó como base esta técnica PCR-REA  a la cual se le agregó un par de cebadores que amplifica una mutación puntal ubicada dentro de un sitio de restricción de la enzima BstEII responsable del patrón característico del subtipo "c". Este último subtipo aún no se descrito en Argentina pero sí en Brasil. En éste nuevo ensayo los productos de PCRs tanto de los virus de referencia (N569 subtipo "a", A663 subtipo "b" y ISO67/89 subtipo "c") como varios aislamientos de campo, fueron secuenciados y analizados con el programa  BioEdit versión 7.0.5.3 (Hall, 1999) para determinar si se trataba del mismo tipo de mutación entre los subtipos. Como se mencionó el ensayo PCR multiplex REA consiste en una reacción de PCR que incluye dos pares de oligonucleótidos, uno de ellos amplifica un punto de mutación que diferencia entre los subtipos "a" y "b" y el segundo amplifica un punto de mutación que diferencia entre los subtipos "a" y "c" seguido posteriormente de la digestión de estos productos con la enzima BstEII. Esto permite la visualización de diferentes patrones de restricción de los productos de PCR en un gel de electroforesis. Primeramente estudiamos los puntos de mutaciones que cambian los sitios de restricción de la enzima BstEII entre los tres subtipos de BoHV5; para ello utilizamos el programa Vector NTI Suite version 8.0 (InforMax Inc-Invitrogen, Merelbeke, Belgium) que nos permitió conocer el número de sitios de restricción de la enzima y cuáles eran sus ubicaciones por genoma. Una vez encontradas las mutaciones diferenciales entre subtipos se procedió a diseñar 2 pares de oligonucleótidos que amplifican éstos sitios de restricción.

            Los resultados obtenidos con la técnica  de PCR después de la digestión con las enzimas de restricciòn mostraron diferentes combinaciones de clivado que se describen a continuación:

 1-En el caso del subtipo "a" que no muestran cambio en estos dos sitios de restricción la banda de 669 pb (UL54) se escindió en dos bandas de 408 y 248 pb; y la banda de 534 pb (UL27) se escindió en dos bandas de 382 y 152 pb.

2-Para los casos del subtipo "b" o "c" muestran digestión de uno u otra banda. Cuando se utilizaron como templado los tres diferentes subtipo de BoHV1 (1.1., 1.2a y 1.2b) el multiplex PCR solo amplifica la banda de 534 pb la cual no es clivada cuando es sometida a digestión con la enzima de restricción, indicando la ausencia del sitio. Sin embargo cuando se utilizó como templado el genoma viral de BuHV1 cepa B6 de referencia se amplifica la banda de 534 pb y se digiere en dos fragmentos del mismo tamaño que para los herpes bovinos 5. Sin embargo no se amplifica la banda de 669 pb., si no una de 850 pb que no contiene sitio de restricción para la enzima BstEII.

Estas diferentes combinaciones de clivado permiten  diferencias entre BoHV-5, BoHV-1 y los subtipos  de BoHV-5.

c)          Evaluación de las muestras:

- Determinación serológica

Se mantienen los porcentajes de seroprevalencia observados previamente con un ligero incremento en la serología positiva a BoHV1.

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Palabras claves: 

Búfalos

Herpesvirus

PI3

BVDV

BRSV