Investigadores

Resumen

Delgado, Fernando Oscar
Blanco Viera, Francisco J.
Moreno, Claudia
Vagnoni, L.
Capellino, Félix Manuel

El desarrollo de cambios inflamatorios con exudado granulomatoso se relaciona con la infección por numerosos agentes de importancia en medicina veterinaria. Los mismos son responsables de importantes pérdidas económicas en animales de producción, resultando en muchos casos además de interés en salud pública.
La detección de este tipo de cambios crónicos permite realizar el diagnóstico de las enfermedades, como así también conocer algunos mecanismos de la interacción entre el patógeno y el hospedador.
En la República Argentina han sido descriptas numerosas causas de inflamación granulomatosa en animales de producción. La infección por Mycobacterium bovis (causante de la Tuberculosis (TB)) es probablemente la principal causa de decomisos por granulomas en bovinos. Otro agente del género causante de Paratuberculosis (PTB), M. avium subsp. paratuberculosis produce disminución de la producción láctea, diarrea y muerte de animales adultos. Ambos microorganismos pueden también afectar a otros rumiantes, afectando a diversos sistemas productivos. Especies del género Brucella causan enfermedad en todos los animales de interés económico, produciendo generalmente afección reproductiva. Otros agentes relacionados a granulomas son las formas intermediarias de Echinococcus granulosus, larvas de Oesophagostomum sp., Corynebacterium pseudotuberculosis y numerosos hongos.
Si bien los cuadros mencionados han sido descriptos en Argentina, sus características patológicas no han sido evaluadas detalladamente. Por otro lado, lesiones como abscesos, neoplasias o alteraciones del crecimiento pueden ser confundidas con granulomas al examen macroscópico. Así, estas formaciones pueden generar un diagnóstico erróneo y afectar la condición sanitaria del establecimiento de origen respecto de algunas enfermedades asociadas a granulomas.
La respuesta inmune es determinante en la formación del granuloma, dependiendo de la misma la patogenia del proceso morboso como la resistencia de los animales a la enfermedad. Si bien esta reacción ha sido parcialmente estudiada en algunas enfermedades del ganado de nuestro país, las características de dicha respuesta en los tejidos no han sido descriptas.
Es objetivo general del presente proyecto caracterizar los diferentes tipos de exudado granulomatoso observados en animales de interés económico de la República Argentina.
Los objetivos específicos son:
-Identificar cambios granulomatosos en animales de interés económico, y describir sus características microscópicas
-En los casos en los que sea posible identificar el agente causal y describir la frecuencia de aparición de cada uno.
-Conocer o estimar el perfil de respuesta inmune desarrollada.

Materiales y métodos
Se colectaron muestras de animales utilizados en los trabajos prácticos de necropsia de la materia "Patología Animal" de la Carrera de Veterinaria de la USal, como también de aquellos enviados para diagnostico al servicio de Patología del Inst. de Patobiología (INTA).
En la tabla 1 se resumen las muestras analizadas durante el período de informe. En la tabla 2 se muestran las diferentes categorías de patrones de lesión observados. Se colectó un total de 50 muestras de órganos. De las mismas, 46 corresponden a órganos con lesiones macroscópicas compatibles con granulomas (33 bovinos, 1 ave, 3 ovinos y 9 caprinos). En las 4 restantes no se observaron lesiones a la necropsia, colectándose la muestra durante la actividad docente.
Las muestras fueron fijadas en solución salina de formaldehído al 10% e incluidas en parafina siguiendo procedimientos de rutina. Secciones de 3μm de todas las muestras fueron coloreadas con hematoxilina y eosina. En la tabla 3 se detallan los criterios microscópicos definidos para cada granuloma.nEn los casos en que se considerara necesario, se realizaron las coloraciones de Gram, Ziehl Nielsen y ácido periódico de Shiff en caso de que fuera necesario.
El perfil de respuesta inmune local desarrollado fue estimado mediante inmunohistoquímica. Se utilizaron como anticuerpo primario 2 policlonales: un anti-γIFN (policlonal, origen conejo, Santa Cruz Biotechnologies) y un anti-IL4 (policlonal, origen cabra, Santa Cruz Biotechnologies). Para estimar el perfil Th2 en caprinos se utilizó un anti-IL10 ((policlonal, origen conejo, Santa Cruz Biotechnologies). El sistema de detección empleado fue el métodoLSAB2+, con los sustratos cromógenos  (DakoR) AEC o DAB, de acuerdo a su disponibilidad.



Resultados
Las muestras obtenidas de los 3 ovinos y las pertenecientes a 14 bovinos no fueron procesadas aun. El perfil de respuesta inmune local fue realizado en 8 caprinos y 3 bovinos.
Los hallazgos microscópicos observados y las coloraciones especiales utilizadas se resumen en la tabla 1.
El estudio microscópico confirmó que todos los órganos con lesiones macroscópicas compatibles con granuloma, se correspondían con un exudado granulomatoso. En las 4 sin cambios macroscópicos también se observó inflamación granulomatosa.
Respecto del perfil de respuesta inmune local, en un caprino con enteritis focal no se encontró inmunomarcación (IMM) para ambas citoquinas. En los restantes 7 caprinos analizados se detectó IMM para γIFN e IL-10 en agregados de macrófagos epitelioides, resultando más intensa para γIFN en todos los casos. Respecto de los 3 bovinos, los resultados fueron similares a los obtenidos en caprinos.

Discusión y conclusiones parciales

Las lesiones descriptas resultaron compatibles con Hidatidosis (2 casos en hígado), Paratuberculosis (10 casos, 2 en bovinos y 8 en caprinos), Tuberculosis bovina (15 casos, uno en un animal con PTB), Aspergilosis (1 caso) y Oesofagostomiasis (5 casos). En un caprino no se identificaron lesiones microscópicas, y 17 muestras se encuentran aun en proceso.
En todos los casos de tuberculosis y paratuberculosis se logró identificar bacilos ácido alcohol resistentes, lo cual colaboró en el diagnóstico de ambas enfermedades. En los granulomas compatibles con hidatidosis no se identificaron microorganismos, resultando de alto valor diagnostico la membrana eosinofílica (hialina) detectada en todos los casos, la cual resulta compatible con la membrana germinal parasitaria. En el pulmón de ave con diagnóstico de aspergilosis, la detección de hifas y conidióforos resultó determinante para determinar la etiología de la lesión.
Los resultados obtenidos indican que, de las enfermedades mencionadas, tuberculosis fue la diagnosticada con mayor frecuencia. Esto estaría relacionado a que existe en Argentina un programa de control y erradicación basado en el diagnóstico y eliminación de positivos, los cuales deben ser sacrificados bajo control veterinario. Este programa permite detectar animales infectados por M. bovis, estimulando la búsqueda de lesiones y su posterior estudio a fin de confirmar el estado de infección. En el caso de brucelosis, si bien existe diagnostico ante-mortem, la enfermedad no produce lesiones macroscópicas en hembras o machos orquidectomizados, las que resultan ser las categorías mas frecuentes en nuestro medio. Esa sería la causa por la cual se detectaran solo 3  casos de brucelosis en ovinos machos, a pesar de que la misma sea endémica en bovinos de nuestro medio. Para el caso de hidatidosis, a diferencia de lo mencionado para TB y Br, no existe un método diagnóstico ante-mortem para animales de producción. Por ello no es posible determinar la afección de los animales en el establecimiento y su posterior seguimiento a faena. Además, considerando que tal enfermedad no determina la condición sanitaria de los establecimientos productivos, el estudio de las lesiones asociadas a esta enfermedad no resulta de interés para propietarios y profesionales, razón por la cual no suelen enviarse a laboratorios para su confirmación. Además, si bien existen programas de control provinciales para esta enfermedad, la especie objeto de control es el canino, en el cual se completa el ciclo parasitario. Estas razones explicarían el bajo numero de muestras analizadas, menor incluso al periodo anterior informado en 2013.
De manera similar a lo informado previamente, resulta llamativa la detección de 3 nuevos casos de tuberculosis meníngea en animales adultos. Esta presentación es poco frecuente en esta categoría, y su presencia podría indicar cambios en la patogenia de la enfermedad, asociados a modificaciones en los sistemas productivos los cuales tienden a ser mas intensivos.
A diferencia de lo informado previamente, todas las lesiones microscópicas fueron coincidentes con los diagnósticos presuntivos realizados. La única excepción podrian ser los casos de granulomas focales con necrosis en el intestino, los cuales podrian considerarse compatibles con TB y resultaron asociados a parásitos (Oesophagostomum sp.). Este error podría relacionarse al estadío de la infestación, ya que si bien usualmente se observa cierto grado de hemorragia, la misma ocurriría al inicio del cuadro por la migración larvaria. En los casos analizados tal característica no fue observada, lo cual aportaría a la posible confusión.
En el intestino de un bovino se observaron lesiones compatibles con 2 enfermedades diferentes (PTB y TB), apoyando la coloracion de ZN el diagnóstico patológico realizado. La deteccion de este cuadro no es frecuente en nuestro país, resultando para los investigadores el primer caso de coinfeccion intestinal con ambos agentes causales (MAP y M. bovis)
El perfil de citoquinas observado en los caprinos contrasta con reportes previos originados en otros países que indican una mayor expresión de γIFN en lesiones focales leves que en lesiones difusas mas graves, comportándose IL-10 de manera inversa. Esta diferencia podría relacionarse con variaciones de la respuesta local frente a Map en Argentina, al estadio de la enfermedad de los animales al momento del muestreo de tejidos, como así también con que el método de detección de citoquinas empleado en ambos trabajos fue diferente. Esto podría ser de importancia en la adopción de medidas de control originadas en otras regiones, las cuales podrian tener efecto variable en nuestro país. Futuros estudios serían necesarios a fin de conocer la respuesta inmune de los animales frente al agente infeccioso, como también para evaluar el efecto de cada uno de los productos a utilizar.
La participación de los estudiantes (51 alumnos cursantes de Patología Animal) en el desarrollo del proyecto colaboró en el abordaje pedagógico de las unidades "Técnica de necropsia, toma y remisión de muestras", "Patología del aparato respiratorio" y "Patología del aparato digestivo". En el marco del proyecto, los estudiantes debieron reconocer en los trabajos prácticos las lesiones de interés, asociarlas a posibles agentes y tomar las muestras ara su posterior estudio. Si bien la existencia del proyecto no implica una actividad diferencial, la utilización del material colectado otorga al acto de muestreo mayor importancia, mejorando la atención de los alumnos comisionados para tal acción. A su vez, en algunos casos el material colectado se utiliza para trabajos prácticos de microscopía, permitiendo a los estudiantes identificar los cambios microscópicos asociados a la lesión seleccionada en la necropsia. Este hecho facilita la relación de los cambios macroscópicos a los histopatológicos, y facilita la comprensión del desarrollo de la inflamación crónica y de otros vinculados con cambios degenerativos y mineralización.

Perspectivas futuras
Debido a que no se han podido analizar todas las muestras colectadas, como así tampoco se ha podido evaluar el perfil de respuesta inmune local de las mismas, sería necesaria una prorroga para el presente proyecto. En este sentido, durante el año siguiente se procedería a procesar las muestras pendientes y a determinar el perfil de respuesta inmune local desarrollado en cada caso mencionado.


Referencias
-Delgado, F. et al. 2009. Expression of NRAMP1 and iNOS in Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis naturally infected cattle. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, doi:10.1016/j.cimid.2009.03.001
-Estrada-Chavez, C. et al. 2001. High-Level Expresión of NRAMP1 in Peripheral Blood Cells and Tuberculous Granulomas from Mycobacterium bovis-Infected Bovines. Infection and Immunity, Nov. 2001, p. 7165-7168 Vol 69, Nro. 11.
-Fiorentino, M.A. et al. 2012. First isolation of Mycobacterium avium Subs. paratuberculosis in a dairy gota in Argentina: Pathology and molecular characterization. Small Ruminant Res., http://dx.doi.org/10.106/j.smallrumres.2012.06.010
-Hernández Pando, R. et al. 2004. Pulmonary tuberculosis in BALB/c mice with non-functional IL4 genes: changes in the inflammatory effects of TNF and in the regulation of fibrosis. Eur J. Immunol, 34, 174-183. 
-Hostetter, J. et al. 2005. Inducible Nitric Oxide Synthase Immunoreactivity in the Granulomatous Intestinal Lesions of Naturally Occuring Bovine Johne´s Disease. Vet Pathol 42:241-249
-Muñoz, M. et al. 2008. Expression of transforming growth factor-beta (TGF-1) in different types of granulomatous lesions in bovine and ovine paratuberculosis. Comp. Immuno. Microb Infect Dis, doi: 10.1016/j.cimid.2007.11.009.

Volver a VETERINARIA  

Palabras claves: 

Patología

Sanidad animal

Granulomas

Caracterización histopatológica