El principal problema que acarrean los productores, no solo de nuestro país sino también del mundo entero, es el relacionado con las enfermedades. Éstas, provocan innumerables pérdidas que van desde una disminución de la producción hasta la muerte de las colonias. En los últimos años se ha estimado que como consecuencia de las enfermedades millones de colmenas mueren anualmente.  Entre los agentes patógenos, los virus juegan un rol fundamental en la producción de enfermedades. Un claro ejemplo es el "Síndrome del Colapso de las Colmenas" que ha llegado a afectar al 90% de colmenares de EEUU.

Si bien la distribución de los principales virus que afectan a las abejas es mundial y a nivel de Sudamérica se ha reportado su  presencia en Brasil y Uruguay, en nuestro país no se conoce nada respecto a la prevalencia de estos virus

Resultados

Implementación de las técnicas de RT- PCR para las principales virosis:

Se puso a punto la técnica de RT-PCR, utilizando técnicas ya probadas (reactivos y

procedimientos) probados y publicados en trabajos científicos, con especial atención a trabajos regionales (Brasil y Uruguay).

De acuerdo a ello se prepararan reactivos y procedimientos para

Virus de alas deformadas (DWV)

Virus de la cría ensacada (SBV)

Virus de Kashmir (KBV)

Virus de la parálisis aguda de lãs abejas (ABPV)

Virus de la parálisis israelí de las abejas (IAPV).

Se analizaron 110 colonias provenientes de zonas de clima templado y subtropical (Ver Tabla 1).

En esta ocasión se detectaron 4 virus circulantes (ABPV, BQCV, CBPV, DWV).

DWV fue el virus más prevalente, detectándose en todos los apiarios muestreados.

Determinación de susceptibilidad de células de insecto a los virus de las abejas.

Se utilizaron tres líneas celulares establecidas de insecto (H-5,SF9 y CRL-1660) para estudiar la susceptibilidad de 3 virus (DWV, ABPV y CBPV).

Luego de tres pasajes ciegos, fue posible mantener  la infección del virus DWV en los cultivos de H-5 y SF9 (determinada por PCR en tiempo real y PCR reversa que detecta cadenas replicativas del virus.

Obtención de cultivos de células de larvas de abejas:

-Se realizaron 5 cultivos de larvas  de diferentes estadios de desarrollo  ( larvas en primeros estadios de desarrollo , larvas de desarrollo medio, larvas de ultimo estadio de crecimiento)

Las larvas  fueron extraídas de las celdas y se procesaron en cabinas de seguridad biológica II A bajo condiciones de esterilidad.

-Se realizaron varios lavados de las mismas con solución Balanceada PBS 1X con antibiótico y antimicótico.

-Se procedió a realizar una desintegración mecánica parte del tejido se sembró  y el resto  del tejido se  procedió a realizar una desintegración enzimática con tripsina 0,25 %

La desintegración del tejido fue total en 20 minutos , la tripsina con las células se coloco en un tubo con SFB para la inactivación de la misma

-Se centrifugó  a 1500 rpm durante 15 minutos

El pellet se resuspendió con medio de cultivo con 10% de SFB

-Se hizo viabilidad de las células y se cuentaron con  azul trypan   en cámara de Newbahuer

-Se pudo observar una gran viabilidad celular  con  una concentración celular  abundante

-Se sembraron 3 frascos con células de cada estadio larvario con diferentes medios de cultivo (TNMFH ,Grace`s  y Exprees Five Medium ) con 10 % de SFB, antibiotico (Pen/estrep/Genta ) y antimicótico ( anfotericina B)

-Se pudo observar tanto en los cultivos de células dispersas como en los macerados de tejidos focos de desarrollo celular a partir de las 96 hs. Se pudieron observar  crecimiento de cèlulas en focos  y desarrollo de células en suspensión

-Se observó crecimiento en todos los medios de cultivos observándose un mayor desarrollo  en el medio TNFH

 Luego de 3 pasajes se observó  un crecimiento celular muy lento se realizo RT-PCR a las células y se pudo comprobar que las mismas estaban infectadas con virus (Virus de las alas deformadas  y virus de las celdas reales negras).

En cultivos primarios realizados de larvas de último estadio de crecimiento provenientes de colmenas tratadas previamente para Varroa, se pudo observar en estas células, con buen desarrollo en el cultivo que las mismas estaban contaminadas con virus.

Se puede inferir que la mayoría de los diferentes estados larvarios de las colmenas utilizadas en esta experiencia para la obtención de células para el cultivo ya han sufrido una infección vertical.

Se pudo observar que los tres pasajes del cultivo original incrementaron la presencia del virus en los mismos lo que indica la susceptibilidad de las células a la infección por estos virus.