Investigadores
Resumen
Caracostantogolo, Jorge Luis
Schapiro, Javier Hernán
1.INTRODUCCIÓN: Dentro de las enfermedades parasitarias que afectan a los ovinos en pastoreo, la gastroenteritis verminosa constituye un grave problema a nivel mundial, cuyas pérdidas directas están relacionadas con la merma de producción de carne, lana, leche, y en casos extremos muerte de los animales severamente afectados. Es ocasionada por nematodos parásitos pertenecientes a diversas familias y géneros que afectan el abomaso e intestinos delgado y grueso, entre las que se destacan Trichostrongylidae (Haemonchus, Teladorsagia,Trichostrongylus y Cooperia), Molineidae (Nematodirus), Ancylostomatidae (Bunostomum) y Strongylidae (Chabertia y Oesophagostomum) (Cordero del Campillo y Rojo-Vázquez, 1999). Habitualmente se presentan en forma mixta o pluriespecífica, es decir que cada hospedador puede albergar simultáneamente a más de una especie parasitaria. En las últimas décadas el control antiparasitario de los ovinos se basó casi exclusivamente en el uso de drogas antihelmínticas, cuyo uso frecuente e indiscriminado, y carente de criterio epidemiológico condujo a la selección de poblaciones de nematodos resistentes. Esta resistencia a los antiparasitarios se encuentra ampliamente distribuida y en algunos lugares torna ineficiente la producción animal, tal es el caso de establecimientos en donde hay ausencia de respuesta al tratamiento frente a todos los grupos químicos. Esta situación amerita plantear cambios en el modo de uso, así como también desarrollar herramientas alternativas o complementarias al control químico. En este sentido, la investigación de extractos de plantas para el control de parásitos en medicina veterinaria tuvo un crecimiento notorio en los últimos 20 años y desde entonces existe un marcado interés para considerarlo dentro de las estrategias no químicas para el control antiparasitario. Estas plantas medicinales se denominan bioactivas, ya que una gran variedad de ellas así como sus extractos contienen compuestos químicos capaces de producir variados efectos terapéuticos, entre los que se informó sobre su capacidad como nematodicidas. Dentro de ellas se destacan las plantas polifenólicas (Lotus spp., Sulla, entre otras) o la corteza de ciertos árboles (Eucaliptus, Pino, Acacia, Quebracho, entre otros) que contienen diferentes concentraciones de taninos condensados en su composición. Precisamente es sobre estos metabolitos secundarios de las plantas que se enfocaron muchos trabajos de investigación dado sus efectos beneficiosos sobre la nutrición y sanidad animal, obteniendo mejoras en los parámetros productivos debidas principalmente a un mejor aprovechamiento de la proteína de la dieta y a una mayor absorción de aminoácidos en el intestino. En este trabajo de investigación se evaluó el efecto directo de extractos vegetales, mediante técnicas in vitro, que ofrecen la posibilidad de medir la actividad antihelmíntica de nuevos compuestos sobre procesos concretos como la eclosión de huevos y la migración de larvas. Los principales ensayos in vitro empleados para demostrar la actividad nematodicida de los extractos vegetales son el test de eclosión de huevos (EHA: egg hatching test) y el test de inhibición de la migración larval (LMIA: larval migration inhibition assay) (Molan et al., 1999; 2000; Coles et al., 2005; 2006). El primero es una modificación del EHA utilizado para evaluar la resistencia antihelmíntica a los benzimidazoles (Coles et al., 1992; 2005; 2006), y consiste en incubar una cantidad conocida de huevos de nematodos gastrointestinales (NGI) de pocas horas de eliminados (frescos, no larvados) frente a concentraciones seriadas de un extracto con potencial actividad antihelmíntica. El LMIA fue desarrollado por Wagland et al. (1992) y modificado por Rabel et al. (1994), y su principio se basa en medir la capacidad migratoria de las larvas infectivas (L3) a través de una malla de 28 μm luego de haber estado en incubación con concentraciones seriadas de un extracto vegetal con potencial actividad antihelmíntica. 2. OBJETIVOS: Objetivo general Poner a punto metodologías in vitro (test de inhibición de la eclosión de huevos y migración larval) destinadas a identificar sustancias vegetales con actividad antihelmíntica Determinar el efecto antihelmíntico de extractos de vegetales autóctonos en la búsqueda de alternativas que puedan sumarse al control de los parásitos. 3. EXPERIMENTOS: 3a. ENSAYOS IN VITRO Objetivos específicos Determinar la actividad antihelmíntica de distintas concentraciones de extractos vegetales autóctonos sobre los estadios de huevos y larvas de una cepa pura de Haemonchus contortus mediante el test de eclosión de huevos (EHA: egg hatching test) y el test de inhibición de la migración larval (LMIA: larval migration inhibition assay). MATERIALES Y MÉTODOS: Lugar de la prueba y período de estudio Esta experiencia se llevó a cabo en el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) de Castelar, Buenos Aires (Argentina). El procesamiento de las muestras de materia fecal, y el desarrollo de las técnicas in vitro se efectuaron en el Área de Parasitología del Instituto de Patobiología, perteneciente al Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y gronómicas (CICVyA). El período de estudio se extendió entre los años 2012 y 2014. Plantas Se seleccionaron plantas de especies autóctonas de las provincias de Chaco, Formosa, Jujuy, Salta y Santiago del Estero. La recolección e identificación taxonómica de las plantas estuvo a cargo de la Ingeniera Agrónoma Renée Fortunato especialista del Instituto de Recursos Biológicos del INTA de Castelar. De cada especie se recolectaron 5 kg de material fresco que representan cerca de 1 kg de materia seca y previo a su procesamiento se separaron por partes de su morfología (raíces, corteza, hojas, flores, frutos, médula, raíz, ramas e inflorescencia) con el objetivo de analizar independientemente sus efectos. Preparación de los extractos vegetales El material vegetal fue pulverizado y 20 gramos se extrajeron con 200 ml de MeOH durante 24 hs. El extracto se filtró a través de papel y se llevó a sequedad en un evaporador rotatorio con una suave corriente de nitrógeno a una temperatura de 40ºC. Después de pesar el residuo, el extracto seco se redisolvió en DMSO hasta una concentración de 80 mg/ml, en base a la materia seca, y se conservó en frascos color caramelo a -20ºC. Para realizar el bioensayo, una alícuota de cada extracto se diluyó 1:10 con DMSO y se esterilizó por filtración a través de membrana de acetato de celulosa de 0,45 μm (Minisart, Sartorius). De este modo, la concentración final fue de 8 mg/ml respecto de la materia seca. Los extractos diluidos se conservaron en viales estériles tipo Ependorff a -70ºC. En este trabajo se llevaron a cabo 2 series de ensayos in vitro utilizando una cepa pura de Haemonchus contortus. En la primera se evaluó la capacidad de los extractos vegetales para inhibir la eclosión de huevos y en la segunda se calcularon los efectos inhibidores sobre la migración de las L3. El soporte utilizado en ambos ensayos fueron placas estériles de cultivo celular multipocillos Falcon™ (de 24 pocillos) de fondo plano con tapa. TEST DE ECLOSIÓN DE HUEVOS Recuperación de huevos y larvas infectivas de Haemonchus contortus Obtención de animales dadores de huevos Se desparasitaron 6 corderos recién destetados (futuros animales dadores) raza Corriedale, con 3 dosis de un Benzimidazol durante 3 días seguidos. A la semana se realizó el análisis coprológico de recuento de huevos por gramo de materia fecal (HPG) mediante la técnica de McMaster modificada para bovinos y ovinos (Robert y O'Sullivan, 1949) para constatar que fueran negativos. Se alojaron en boxes cubiertos del campo experimental del INTA de Castelar. Estos tienen piso metálico en rejilla, elevado sobre piso de concreto para que los animales no estén en contacto con la humedad, con comedero y bebedero, y se los alimentó con pellets de alfalfa y agua fresca ad libitum. Allí permanecieron durante todo el período que fueron animales dadores de huevos para obtener larvas infectivas. A cada uno de los corderos se les administró experimentalmente 5.000 L3 de una cepa pura de Haemonchus contortus por vía oral con una jeringa de 50 cc acoplada a una sonda de látex. A partir del día 21 post-inoculación se comenzó diariamente a obtener materia fecal directamente del recto con bolsas de polietileno y a monitorear la oviposición mediante la técnica de HPG. Con esa materia fecal positiva se realizaron coprocultivos mediante la técnica de Corticelli y Lai (Corticelli y Lai, 1963) para disponer de un número importante de larvas infectivas para los ensayos. Estas se conservaron en heladera entre 4ºC y 8ºC hasta su administración a cada animal del ensayo experimental. Cada inóculo de suspensión larval se preparó en un volumen de 20 cc de agua libre de cloro. Técnica de aislamiento de huevos La técnica que se utilizó es una adaptación del Protocolo Nº 3/2009 del laboratorio de Sanidad Animal del Embrapa Pecuária Sudeste, Sao Carlos-Sao Pablo, BRASIL. Se recolectó materia fecal fresca de pocas horas de eliminada mediante el uso de arneses de tela colocados en corderos infectados experimentalmente con una cepa pura de H. contortus que presentaron un recuento de HPG superior a 2.000 (Figura 1). Se colocaron en bolsas plásticas a la que se agregó agua tibia (± 40ºC), se homogeneizó y disgregó a mano. Luego se procedió a filtrar esa dilución a través de 4 tamices: primero por el de 60 meshes (250 μm de apertura entre hilos), segundo por el de 80 meshes (177 μm de apertura entre hilos), tercero por el de 200 meshes (74 μm de apertura entre hilos) y finalmente por el de 500 meshes (25 μm de apertura entre hilos). En los 3 primeros filtros, se enjuagó el tamiz recolectando el líquido filtrado recuperando los huevos. El último tamiz de 25 μm se lavó con pizeta con agua destilada para retirar los huevos que quedaron retenidos, y se transfirieron a tubos cónicos de centrífuga de 50 ml. Con el fin de clarificar la muestra, se centrifugaron durante 5 minutos a 3.000 rpm, se descartó el sobrenadante y se completó el tubo de centrífuga con una solución sobresaturada de cloruro de sodio (NaCl). Se centrifugó nuevamente durante 5 minutos a 3.000 rpm, se volcó el sobrenadante en un tamiz de 25 μm y se lavó con agua destilada. Se vertió lo retenido en el tamiz de 25 μm a un vaso cónico de 500 ml y se lo dejó decantar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se extrajo el sobrenadante por sifonación y se recuperaron los huevos a partir del sedimento. A continuación se procedió a efectuar el conteo en microscopio óptico (40X) estableciendo el valor promedio de 6 alícuotas de 40 μl cada una. Procedimiento Se evaluaron 6 concentraciones de cada extracto vegetal (250µg/ml; 125µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml; 15,62 µg/ml y 7,80µg/ml) con 3 réplicas cada una, además de un Control negativo (huevos en agua destilada) que se analizó por triplicado en forma simultánea y de un Control del efecto de DMSO. Inicialmente se agregaron en cada uno de los pocillos 20 μl de agua destilada con aproximadamente 100 huevos de H. contortus. Luego se les adicionaron las distintas concentraciones de extractos vegetales hasta alcanzar un volumen final de 2 cc en cada pocillo. Finalmente se agregaron los controles negativos. Se identificaron las placas y se acondicionaron en estufa por 24 hs a 27ºC y 85% de HR para permitir que los huevos eclosionaran al estadio de L1. Transcurrido ese lapso de tiempo, se detuvo el proceso de incubación mediante el agregado de una gota de colorante de Lugol, y se procedió a la lectura en microscopio invertido a 40X (Figura 2). En cada pocillo se contabilizó la cantidad de huevos y de larvas L1 y se calculó el porcentaje de eclosión para cada dilución de extracto vegetal relacionando la cantidad total de L1 y de huevos. La fórmula empleada para calcular el porcentaje de inhibición de la eclosión de huevos en cada concentración de extracto utilizada fue la siguiente: % de inhibición de la eclosión de huevos = 100 X Número de huevos Número de huevos + larvas TEST DE INHIBICIÓN DE LA MIGRACIÓN LARVAL El procedimiento utilizado en este experimento fue el descripto por Demeler (2005; 2010). Se empleó un dispositivo de filtros realizado con tubos de acrílico transparente de 2 cm de largo y 8 mm de diámetro interno a los que se les adhirió una malla de nylon de 28 μm en uno de sus extremos (Figura 3) que permite la migración de las larvas. Procedimiento Al igual que lo realizado en el test de inhibición de la eclosión de huevos Se evaluaron 6 concentraciones de cada extracto vegetal (250µg/ml; 125µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml; 15,62 µg/ml y 7,80µg/ml) con 3 réplicas cada una, además de un Control negativo (L3 en agua destilada) que se analizó por triplicado en forma simultánea y un Control del efecto del DMSO. En cada pocillo se colocaron aproximadamente entre 90 a 100 L3 contenidas en un volumen de 20 μl de agua destilada, a los que se les agregó las diluciones de extractos hasta alcanzar un volumen final de 2 cc en cada pocillo. Estas placas (placas de incubación) (Figura 4) se llevaron a estufa para incubación por 24 hs a 24ºC y 85% de HR. Transcurrido el tiempo de incubación, los contenidos de cada réplica fueron transferidos a una nueva placa (placa de migración) a través de los filtros colocados en las filas A y C (2 réplicas) (Figuras 5 y 6). Se colocó nuevamente en incubación por el término de 24 hs a 24ºC y 85% de HR para permitir que las L3 migraran a través de la malla. Finalizada la segunda incubación, se quitaron los tamices enjuagando cuidadosamente el contenido en los pocillos El contenido del filtro (larvas que no pudieron migrar) se invirtió sobre los pocillos adyacentes (filas B y D) para favorecer el conteo (Figura 7). Se observó en microscopio invertido y se contabilizaron las larvas que migraron y las que no pudieron hacerlo. Finalmente se calculó el porcentaje de larvas no migradas con respecto al número total de larvas mediante la siguiente fórmula: % de inhibición de la migración larval = 100 X Número de larvas no migradas Número total de larvas RESULTADOS: Test de inhibición en la eclosión de huevos (EHA): En los siguientes cuadros se presentan los diferentes porcentajes de inhibición en la eclosión de huevos obtenidos frente a las distintas concentraciones de familias de extractos vegetales. Se evaluaron 53 extractos diferentes, y se observó una clara respuesta dosis dependiente, dado que a las más altas concentraciones (6,25 mg/ml) demostraron tener mejor efecto, alcanzando en el mejor de los casos valores de 30% a 40% de inhibición de la eclosión de huevos. Test de inhibición en la migración larval (LMIA) En el Cuadro 2 se presentan los resultados de los 50 extractos vegetales evaluados. Los resultados concuerdan con lo observado en el test EHA en cuanto a que los porcentajes de inhibición se incrementaron con el aumento de las concentraciones, evidenciándose una clara respuesta dosis dependiente. CONCLUSIÓNES DE LOS ENSAYOS IN VITRO: Se logró poner a punto 2 técnicas in vitro: test de inhibición de la eclosión de huevos y test de inhibición en la migración larval que fueron utilizadas para el screening de varios extractos vegetales con el fin de identificar a los que tienen efecto antihelmíntico actuando sobre procesos concretos como la eclosión de huevos y la migración de larvas. En este trabajo de experimentación se pudo observar que tanto la inhibición de la eclosión de huevos como la inhibición de la migración larval fueron dosis dependientes, es decir que los mayores porcentajes de inhibición se produjeron en aquellos pocillos donde los huevos y las larvas estaban enfrentados con las mayores concentraciones de extractos vegetales, y este valor fue decreciendo a medida que disminuían las concentraciones hasta alcanzar un valor mínimo en el último pocillo. Esto indica que las técnicas utilizadas fueron adecuadas y confiables para ser utilizadas en el screening primario de sustancias con actividad nematodicida. Los porcentajes de inhibición en la eclosión de huevos hallados en estos experimentos están en el orden de los que se obtienen cuando se utiliza thiabendazole en pruebas para el diagnóstico de resistencia con el test EHA (Cutullé, 2005). Debido a que el DMSO contenido en el solvente de los extractos vegetales tiene efecto deletéreo sobre huevos y larvas, no se pudo medir la actividad antihelmíntica en concentraciones mayores a 250 µg/ml. Las técnicas in vitro empleadas fueron de utilidad para detectar los extractos de los vegetales que podrían ser candidatos en estudios futuros. Una evaluación ulterior debería tener en cuenta: el efecto antihelmíntico y la inocuidad de concentraciones mayores a las utilizadas en estas experiencias, la abundancia del vegetal en la naturaleza, su palatabilidad, la posibilidad de cultivo, sus ventajas y desventajas para la conservación del suelo, su crecimiento y expansión controlables, la posibilidad de incluirlo en formulaciones de administración sencilla en las que su actividad no decaiga o lo haga lentamente, etc. 3b. ENSAYO IN VIVO: Se estudió el efecto de un extracto de tanino condensado del Quebracho a 50mg/ml sobre la viabilidad de larvas de Trichinella spiralis expuestas in vitro durante 18 horas previo a su inoculación en ratones BALB/c y la eficacia antihelmíntica in vivo del mismo extracto sobre larvas de T. spiralis 6 horas post inoculación en la misma cepa de ratones. La evaluación del efecto de los tratamientos se hizo en base al conteo de T. spiralis adultos llevado a cabo en el 5to día post inoculación y expresando los resultados como % de inhibición del desarrollo. Este modelo provee resultados confiables debido a la adaptación hospedador- parásito resultante de la especificidad filogenética y al conocimiento de las etapas del ciclo biológico que muestran escasa variabilidad. Objetivo específico Determinar la eficacia del tratamiento con un extracto de tanino condensado de Quebracho (Schinopsis balansae) sobre los estadios de larvas Trichinella spiralis en ratones infestados experimentalmente. MATERIALES Y MÉTODOS: Lugar de la prueba y período de estudio Esta experiencia se llevó a cabo en el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) de Castelar, Buenos Aires (Argentina). El procesamiento de los animales y el desarrollo de las técnicas in vivo se efectuaron en el Área de Parasitología del Instituto de Patobiología, perteneciente al Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA). Animales y alimentación Para la realización de este experimento se utilizaron un total de 24 ratones BALB/c hembras de 4 meses de edad, procedentes del bioterio del INTA de Castelar, similares a los que se utilizan para el mantenimiento de una cepa de Trichinella spiralis. Todos los ratones estuvieron alojados en grupos de 3 en jaulas metálicas de 24 x 13.5 x 13 cm, bajo condiciones controladas de temperatura (21ºC) y humedad constantes, y recibieron alimento balanceado y agua "ad libitum". Diseño experimental Se formaron 4 grupos experimentales homogéneos de 6 animales cada uno, y recibieron una inoculación experimental (IE) por vía oral de 800 L1 de Trichinella spiralis de acuerdo con el siguiente esquema: Grupo A: IE 800 L1 1- Sin tratamiento previo 2- Sin tratamiento posterior Grupo B: IE 800 L1 1- 18 h de incubación en TCQ 2- Sin tratamiento posterior Grupo C: IE 800 L1 1- Sin tratamiento previo 2- TCQ 2 mg en 40 40µl vía oral a 6 hs post IE Grupo D: IE 800 L1 1- Sin tratamiento previo 2- FENBENDAZOL 100µg en 40µl vía oral a las 6 hs post IE Al 5to día post inoculación, todos los ratones fueron sacrificados por dislocación cráneo-cervical. Se abrió la cavidad abdominal por la línea media y se procedió a aislar el intestino. Se lo abrió longitudinalmente en toda su extensión, se lavó su contenido y se recuperaron los estadios adultos de T. spiralis en cada uno de ellos. Cálculos: Para estimar la eficacia antihelmíntica se utilizó la siguiente fórmula (Coles et al., 1992) % de Inhibición del desarrollo: MECON - METRAT x 100 MECON Siendo: MECON: media aritmética de la carga parasitaria en el grupo Control METRAT: media aritmética de la carga parasitaria en el grupo Tratado Análisis estadístico: Los valores de carga parasitaria de adultos de T. spiralis fueron estudiados mediante el programa SAS (Statistical Analisys System) procedimientos ANOVA para análisis de Varianza y test de Tukey para hallar diferencias entre las medias. RESULTADOS: Cuadro 3 y Figura 8 CONCLUSIONES DEL ENSAYO IN VIVO: El tratamiento previo de las larvas L1 de T. spiralis con una solución de TCQ logró afectar su desarrollo, lo que se manifestó por una cantidad inferior de estadios adultos recuperados en el tracto intestinal. La inhibición del desarrollo obtenida mediante el tratamiento 6 horas post inoculación experimental fue inferior a la obtenida cuando se expusieron las larvas in vitro previamente. Esto pudo deberse a un tiempo insuficiente de contacto del activo con el parásito o a la utilización de una dosis inferior a la adecuada (sobre todo en el grupo tratado con fenbendazole). El modelo empleado se diseñó para determinar si los compuestos a probar, con efecto in vitro sobre estadios larvales, conservaban su actividad en el medio gastrointestinal. Con modificaciones en el tiempo transcurrido entre la inoculación experimental y el momento del tratamiento, se podría estudiar el efecto sobre estadios adultos. Además, utilizando grupos accesorios, podría determinarse la dosis efectiva y su comparación de potencia con antiparasitarios conocidos. CONCLUSIÓN GENERAL: Se considera que este proyecto ha sido fructífero porque produjo información sobre el efecto antihelmíntico de extractos vegetales, hallando candidatos que merecerían seguir siendo estudiados y además porque permitió poner a punto dos técnicas para estudio in vitro y un modelo in vivo que son confiables para su utilización como herramientas de screening y desarrollo de nematodicidas. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: COLES G.C., JACKSON F., POMROY W.E., PRICHARD R.K., SAMSON-HIMMELSTJERNA G., SILVESTRE A., TAYLOR M.A., VERCRUYSSE J., (2006). The detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. Veterinary Parasitology 136: 167-185. COLES G.C., (2005). Anthelmintic resistance - looking to the future: a UK perspective. Research in Veterinary Science 78: 99-108. COLES G.C., BAUER C., BORGSTEEDE F.H.M., GEERTS S., KLEI, T.R., TAYLOR M.A. AND WALLER P.J., (1992). World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.). 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