Investigadores

Resumen

Farinati, Alicia Esther
Santiso, Gabriela Maria
Quinteros, Mirta Graciela
Arcos, Marisa
Marques, Melina Daiana

Los objetivos de este trabajo fueron: 1-estudio comparativo de las biopelículas (BP) de las diferentes especies de Candida; 2-estudio comparativo de la actividad de los antimicóticos fluconazol y voriconazol en células planctónicas y en BP;  3-estudio de las modificaciones que producen dichos antimicóticos en concentraciones CIM y subCIM en las BP de cada especie de Candida. Hemos comprobado la actividad del fluconazol en concentraciones CIM y subCIM sobre las diferentes etapas de las BP: adherencia y dispersión.
1. AVANCE PRESENTADO EN 2013 DEL PROYECTO QUE CONTINUÓ EN 2014In vitro biofilm (BF) formation of Candida albicans (CA) planktonic isolates from urogenital tract (UGT) susceptible (S) and multiresistant (MR) to azoles
Farinati A; Marqués M; Sibert, L; Arcos, M; Santiso, G Microbiology Department, Facultad de Medicina, Universidad del Salvador, Buenos Aires, Argentina 
Candida spp are BF producers and are frequently observed in medical devices as in gastrointestinal and urogenital normal flora. There are many reports about an altered phenotype in BF with respect to growth rate, gene transcription and resistance increase, but few reports about BF behavior of susceptible and resistant planktonic isolates from UGT when the BF is fully developed as normal flora or in pathological situations. Aim: to study S and MR planktonic isolates of CA from UGT and evaluate their behavior in BF. Material and methods: The CA susceptibility to azoles was performed by CLSI rules.  We used 20 CA S: fluconazol (FCZ) MIC ≤ 2μg/ml; itraconazole (ITZ) <1 μg/ml; voriconazole (VCZ) ≤0.125 μg/ml, and 5 CA MR. We study 1 CAMR isolate from catheter (FCZ >256 μg/ml; ITZ >32μg/ml; VCZ >32μg/ml) as control.  All isolates were incubated 24-48 hours in Sabouraud broth (SB). The CA BF of each isolate was investigated using: a glass coupon (GC); a GC with vaginal layer (previously described) and acetate film. Each of them was placed in the SB and then we read by optical microscopy after 24 and 48 hours of incubation. We used microtiter assay (MA) for studying quantitatively BF formation. Following 24 hours and remotion of planktonic CA, the crystal violet tinction was employed. A RT-2100C microprocessor (absorbance mode λ 450nm) was employed for reading. Results: BF was detected in all isolates but the exopolisacharide (EPS) formation, thick and density in some CAS were deficient.  Usually BF with blastospores, pseudohyphae, hyphae and EPS was present in CAMR. Conclusions: the previous susceptibility of CA is important in the BF formation. The MR is a risk factor to eradicate CA from host not only by resistance but due to their higher relative intensity of BF formation as virulence factor. SOGIBA (2012)Aislamientos urogenitales de Candida albicans (CA) resistentes a los azoles (AZ) en estado  planctónico y su comportamiento in vitro en la formación de biopelículas (BP) Farinati Alicia, Arcos Marisa, Sibert Leticia, Marqués Melina, Gabriela Santiso  CA es la levadura más común en las infecciones relacionadas a BP en superficies abióticas. Nosotros las hemos demostrado en la vagina integrando la microbiota normal y en las candidiasis vaginales. Se conoce que CA, como otros microorganismos, cuando están en las BP se asocian significativamente con una elevada resistencia a antimicrobianos (AM) comparada con sus formas planctónicas (PL). No se ha investigado en profundidad qué ocurre con PL de CA previamente resistentes. Por otro lado se ha incrementado el uso de azoles (AZ) en  pacientes sometidos a terapia intensiva con AM que es un riesgo para la selección de especies resistentes ya sea naturales o no a los mismos. La formación de BP podría  ser crítica en el desarrollo de procesos crónicos en el tracto genital inferior femenino  (TGIF) y dificultar la erradicación de CA. El objetivo de nuestro trabajo fue estudiar el comportamiento en la formación de BP de formas planctónicas de aislamientos urogenitales de CA con multirresistencia (MR) a los AZ (CAMR). La sensibilidad a los AZ fue determinada de acuerdo a las normas del Control Laboratory Standards Institute (CLSI). Usamos 20 aislamientos de CA sensibles (S) (CAS): fluconazol (FCZ) CIM ≤ 2μg/ml; itraconazol (ITZ) <1μg/ml; voriconazol (VCZ) ≤0.125μg/ml y 5 CA MR con CIM superiores a 8μg/ml. Estudiamos 1 CAMR recuperada de catéter como control FCZ >256μg/ml; ITZ >32μg/ml; VCZ >32μg/ml. Todos los aislamientos fueron incubados 24-48h en caldo Sabouraud (CS). La BP de dada aislamiento de CA se investigó usando dispositivos de vidrio (DV); DV con una capa de células vaginales (descrito en trabajos previos) y película o film de acetato. Cada uno de ellos fue dispuesto en el CS (2 por aislamiento) y luego de 24-48 horas de incubación, se lavaron, colorearon con cristal violeta (CV) y con naranja de acridina (NA) y se leyeron con microscopio óptico y de fluorescencia. Usamos microplacas (MP) para estudios cuantitativos en la formación de las BP. Después de 24 horas de incubación se tiñeron con CV y se leyeron con un microprocesador RT-2100 (absorbancia λ 450nm). La BP fue detectada en todos los aislamientos con diferente constitución pero el exopolisacárido,  evidenciado notoriamente con el NA, fue más exuberante en CAMR que en CAS. Usualmente la BP con blastosporos, hifas y EPS estuvo presente en CAMR y sólo en algunas de las BP de CS. La sensibilidad de CA a los AZ previa a su constitución como BP es importante no sólo por la resistencia en si (eventualmente soslayable con mayores dosis) sino también debido a la intensidad de su BP como factor de virulencia y la posibilidad del progreso hacia una condición crónica. Dinámica de biopelículas en el tracto genital inferior de la mujer en edad reproductiva con y sin infecciones bajo la influencia del estradiol y fluconazol: estudio in vitro AE Farinati, M Marqués, A Orsini2. Comportamiento de levaduras del género Candida planctónicas y en las biopelículas frente a diferentes concentraciones de Fluconazol y Voriconazol)Las biopelículas (BP) en el tracto genital inferior (TGI) juegan un rol importante en la durante la edad reproductiva de la mujer (MER). Previamente ya habíamos estudiado  el comportamiento de los microorganismos de la microbiota vaginal sobre capas de células vaginales en la formación de la misma y su evolución en MER sin infecciones. Objetivo: estudiar el comportamiento de las BP vaginales en mujeres con infecciones endógenas del TGI   bajo el desafío del hemisuccinato de estradiol (EH) y fluconazol (FCZ).Metodos: se estudiaron muestras vaginales de   37 MER correspondiendo 16 a microbiota normal (MN) y 21 a infecciones endógenas: 10 candidiasis (CVV); 11 vaginosis bacteriana (VB). Se usaron aislamientos clínicos de Candida albicans (CA) y levaduras no Candida albicans (CNA) como controles. Las BP vaginales se investigaron  cualitativamente usando capas de células vaginales en dispositivos de vidrio (DV) según técnicas ya descritas, 6 por cada mujer. También se prepararon con esta técnica las BP de CA y CNA. Los DV de cada paciente y los de los controles fueron colocados en caldo tripteína soja a pH 6.5, en caldo Man Rogosa Sharpe a pH 4.5 y en caldo Sabouraud.  Usamos 200 μg/ml de hemisuccinato de estradiol  (HE) en todos los casos  y 6 ug/ml de fluconazol (FCZ) como agentes estresantes. Este último  fue empleado solamente en los casos de CVV  y en los controles. Todos los DV fueron leídos con microscopio optico y previa tinción con Gram y cristal violeta respectivamente, después de   24 y 48 horas de incubación. Se prepararon también BP con los controles para ser teñidos con naranja de acridina (NA) y posterior lectura con microscopio de fluorescencia. Resultados: los cocos grampositivos (CGP) inician la formación de las BP en los casos de MN, CVV y VB. Actividad del HE:  en la MN interfiere con  los CGP en el inicio de la BP . En la  VB detectamos piezas de BP desplazadas de la superficie de las células y dispersión.  En la CV el  HE estimula a ambos pH  la formación de la BP con blastosporos, pseudohifas e hifas. En los controles se detectó formación de BP en todos los casos  pero con diferente constitución según la especie. El exopolisacárido fue más evidente en las BP de NAC y sin influencia de HE. y demostrado eficientemente con el NA.  Actividad del FCZ en CVV y sobre los controles : no observamos influencia en la adherencia ni en la dispersión de las BP. Conclusiones: a pesar de que Lactobacillus spp son las especies predominantes en la vagina de las MER, los CGP son los primeros en aparecer en las BP. En cuanto a la actividad del HE las observaciones sugieren que puede funcionar como promotor o inhibidor de las BP vaginales de acuerdo con la etapa del proceso y la patología infecciosa y es un factor a considerar para propósitos terapéuticos. La promoción de las BP de c3. Influencia del estradiol y fluconazol in vitro sobre la dinámica de las biopelículas vaginales  en mujeres en edad reproductiva con y sin infecciones del tracto genital  Alicia Farinati ; Agustina Souto, Melina  Marques, A. OrsiniCátedra de Microbiologia y Parasitologia - Facultad de Medicina. Cátedra de extracurricular de biopelículas  Universidad del Salvador; Buenos Aires, Argentina Resumen: Las biopelículas (BP) en el tracto genital inferior (TGI) juegan un rol importante en la durante la edad reproductiva de la mujer (MER). Previamente ya habíamos estudiado  el comportamiento de los microorganismos de la microbiota vaginal sobre capas de células vaginales en la formación de la misma y su evolución en MER sin infecciones. Objetivo: estudiar el comportamiento de las BP vaginales en mujeres con infecciones endógenas del TGI   bajo el desafío del hemisuccinato de estradiol (EH) y fluconazol (FCZ). Métodos: se estudiaron muestras vaginales de   37 MER correspondiendo 16 a microbiota normal (MN) y 21 a infecciones endógenas: 10 candidiasis (CVV); 11 vaginosis bacteriana (VB). Se usaron aislamientos clínicos de Candida albicans (CA) y levaduras no Candida albicans (CNA) como controles. Las BP vaginales se investigaron  cualitativamente usando capas de células vaginales en dispositivos de vidrio (DV) según técnicas ya descritas, 6 por cada mujer. También se prepararon con esta técnica las BP de CA y CNA. Los DV de cada paciente y los de los controles fueron colocados en caldo tripteína soja a pH 6.5, en caldo Man Rogosa Sharpe a pH 4.5 y en caldo Sabouraud.  Usamos 200 μg/ml de hemisuccinato de estradiol  (HE) en todos los casos  y 6 ug/ml de fluconazol (FCZ) como agentes estresantes. Este último  fue empleado solamente en los casos de CVV  y en los controles. Todos los DV fueron leídos con microscopio óptico y previa tinción con Gram y cristal violeta respectivamente, después de   24 y 48 horas de incubación. Se prepararon también BP con los controles para ser teñidos con naranja de acridina (NA) y posterior lectura con microscopio de fluorescencia. Resultados: los cocos grampositivos (CGP) inician la formación de las BP en los casos de MN, CVV y VB. Actividad del HE: en la MN interfiere con  los CGP en el inicio de la BP. En la VB detectamos piezas de BP desplazadas de la superficie de las células y dispersión.  En la CV el  HE estimula a ambos pH  la formación de la BP con blastosporos, pseudohifas e hifas. En los controles se detectó formación de BP en todos los casos  pero con diferente constitución según la especie. El exopolisacárido (EPS) fue más evidente en las BP de NAC y sin influencia de HE y demostrado eficientemente con el NA.  Actividad del FCZ en CVV y sobre los controles: no observamos influencia en la adherencia ni en la dispersión de las BP. Conclusiones: a pesar de que Lactobacillus spp son las especies predominantes en la vagina de las MER, los CGP son los primeros en aparecer en las BP. En cuanto a la actividad del HE las observaciones sugieren que puede funcionar como promotor o inhibidor de las BP vaginales de acuerdo con la etapa del proceso y la patología infecciosa y es un factor a considerar para propósitos terapéuticos. La promoción de las BP de Candida spp tanto en la CVV como en los controles por parte del HE sugiere que este podría inducir alguna alteración en los sitios receptores celulares para el FCZ.4. Estradiol  and fluconazole influence in  Lower Genital Tract Biofilm Dynamic of sexually active women with and without endogenous infections: in vitro studyAbstract: the biofilm (BF) lifestyle of microbial flora in vaginal tract plays an important role in the reproductive health of sexually active women (SAW). We previously study the BF in the genital tract in different situations mainly under antimicrobial stress. Our objective is to describe the vaginal BF (VBF) 1-from starting in SAW without genital infections and 2-the behavior of VBF in normal cases and in endogenous infections under challenged by estradiol hemisuccinate  (EH) and fluconazole  (FCZ). Methods: vaginal samples were collected from 37 SAW : normal flora (NF) 16, endogenous infections 21: candidiasis (VVC) 10; bacterial vaginosis (BV) 11.The VBF was investigated using vaginal layers in glass coupon (GC) for each patient (previously described) and microtiter assays (MA) for quantitative studies . The glass coupon (GC) was immediately placed in Trypticase Soy Broth pH 6.5, in Man Rogosa Sharpe pH 4.5 and in Sabouraud Broth.  We use EH (200 μg/ml) and FCZ (6 ug/ml) as stress agents. The last was employed in VVC cases using Candida albicans (CA) and non albicans Candida (NAC) isolates as control with similar techniques. Escherichia coli (EC) as common microorganism from genital tract were used to form mixed biofilm with CA and NAC.  Everything was read by optical microscopy previous tinction with crystal violet and Gram after 24 and 48 hours. Besides in VVC cases and their controls, GC were stained with Gram, acridine orange (AO) and use fluorescence microscope. Results: Gram positive cocci (GPC) initiate the BF formation in NF, VVC and BV. Activity of EH: In NF interferes with GPC,and gram positive bacilli in the starting of BF. In BV we detected BF pieces detachment and dispersion. In VVC: EH estimulation at both pH was observed (BF with blastospores, pseudohyphae and hyphae). BF formation in all Candida isolates was detected but with different constitution. The exopolisacharide (EPS) was better demonstrated with AO and was more evident in NAC without influence of EH. EH improves EC BF in the early stage but at 24 hours fragmentation and dispersion was shown Activity of FCZ : we observed  that EC form mixed BF with CA and NAC but was more evident with NAC. FCZ has not influence on adherence or dispersion in mixed BF but has reduced activity in CA and NAC BF monospecies. Conclusions: Despite Lactobacillus are predominant bacterial species in the vagina, GPC`s are the first to appear in BF. Our observations suggest that EH can function as promoter or inhibitor of BF in according to developmental process and pathologies. The BV BF dispersion and detachment as the dispersion of EC BF are factors to considerer for therapeutic proposals. CA BF is always promoted by EH. These data suggest that EH could induce alteration in fungal receptor sites.FCZ has not influence in mixed BF and we think that FCZ activity can be reduced by BF presence and not by EC modulation5. Actividad del FCZ en CVV y sobre los controles: no observamos influencia en la adherencia ni en la dispersión de las BP. Discusión Para los estudios clásicos de la microbiota vaginal se  tomaron en cuenta los microorganismos planctónicos. Sin embargo en las mucosas predominan como BP.  Como sabemos estas son comunidades sésiles muy dinámicas de microorganismos, caracterizada por células irreversiblemente unidas a un sustrato o interfaz o entre sí, embebidas en una matriz extracelular de sustancias polimerizadas producidas por ellas y que exhiben un fenotipo alterado con respecto al índice de crecimiento y transcripción de genes19, 20, 21.Estos estudios sobre capas de células vaginales y en DV nos permitieron conocer la dinámica de la microbiota vaginal como BP. Los lactobacilos reconocidos como predominantes en la vagina de las mujeres en edad reproductiva  desempeñan un rol preponderante debido a sus aspectos metabólicos  principales como son la producción de ácido láctico y agua oxigenada. El primero mantiene un pH no superior a 4.5 y la segunda bloquea el desarrollo exuberante de los microorganismos anaerobios y de todos aquellos que carecen de catalasa, como Gardnerella vaginalis. Ambos factores junto a otros como la lactocina son los responsables de mantener la denominada microbiota normal o habitual del  tracto genital inferior femenino. Numerosas son las especies que la constituyen y sólo puede profundizarse un estudio detallado mediante técnicas moleculares, pero la dinámica de su composición es posible investigarla aún con técnicas más simples como las empleadas en este trabajo.  Es lógico pensar que los lactobacilos deberían ser los iniciadores de la microbiota  pero en realidad aparecen tardíamente y son los estreptococos los que la inician.  Ocurre algo similar en la zona orofaríngea. Aquí se distinguen los colonizadores tempranos, medios  y los tardíos siendo los primeros los que adhieren al enamel dentario efectuando una coagregación que da base a los colonizadores medios y tardíos posteriormente. Se pudo demostrar que usando métodos tradicionales22 y otras técnicas basadas en AND-AND hibridización o probes 23, que lo estreptococos, especialmente S.oralis/grupo Streptococus mitis eran los que dominaban el inicio.    En la vagina podría  ocurrir algo similar y los estreptococos ser los iniciadores por un mecanismo de coagregacion y luego aparecer los otros microorganismos constituyentes de la microbiota determinando o cooperando con la conformacion de la BP24.Es necesario señalar que, asi como ocurre con la saliva interviniendo activamente  en la zona orofaríngea, los componentes de las secreciones y las hormonas sexuales en el tracto genital serian también responsables del  proceso de formación de la BP vaginal y su dinámica. El HE que utilizamos en las experiencias sobre capas de células vaginales, demostró  una activa participación facilitando o dispersando a las BP.  Recordemos que  además de receptores para los estrógenos25 y otras moléculas, como los receptores  Toll-like, las células vaginales producen un gran rango de compuestos con actividad antimicrobiana y que reconocen los patógenos asociados a determinados patrones moleculares26. Cuando analizamos la actividad sobre la microbiota normal observamos que el HE inhibe o dificulta la colonización temprana de cocos gram positivos mientras que en los casos de infecciones endógenas,  incrementa la formación de BP de Candida spp independientemente de la especie considerada y de la formación mayor o menor de EPS. Esta podría ser la explicación del efecto de ciertos anticonceptivos que poseen estrógenos en su composición en las mujeres que recurren a ellos 27. A veces es necesario suspender la administración de los mismos sobre todo en pacientes que tienen CVV recurrente. Dicho comportamiento es similar al que tienen los estrógenos en las infecciones por Chlamydia. En los casos de VB el comportamiento del HE es diferente ya que provoca el desprendimiento entero o de piezas de la BP que se forma sobre las células   que dan lugar a su alteración o destruccion (clue cells o celulas guia). El pH no afectó ninguno de los comportamientos en las infecciones endogenas consideradas ya que no hubo diferencias en las experiencias efectuadas en el medio Sabouraud   y en el Man Rogosa Sharpe a pH 4.5.Los resultados de la  actividad de FCZ sobre la formacion de las BP de Candida spp coincide con las observaciones efectuadas por Kaneko y cols.28 que demostraron  que el FCZ  que es fungistático para las células planctónicas no erradicaba la BP sobre la superficie del disco usado como soporte. Otro antifúngico como la micofungina  que es fungicida,  es capaz de suprimir el crecimiento a los pocos minutos de adicionado a la BP en formacion29,30.  No pudimos demostrar  con el FCZ actividad en la adherencia ni en la dispersion de las BP de Candida spp  ya que no  hubo variación en las mismas  con la adicion del FCZ a la hora ni a las 4 horas de iniciada la misma. Su comportamiento puede variar en BP mixtas15.Esto sería consecuencia de algún tipo de alteración en los sitios receptores para la actividad  del antimicótico.
Es importante tenerlo en cuenta en el momento de elegir un antimicótico  sobre todo en las candidiasis severas  o complicadas pues si no se efectúan tratamientos prolongados  puede haber fracaso terapeútico.  
Dado el comportamiento dual  del HE es posible considerar su uso supletorio local  en ciertas patologías que pueden ser condicionantes de otras , como las infecciones urinarias que suelen presentarse en mujeres posmenopaúsicas que padecen alteraciones de la microbiota del tracto vaginal. Conclusiones: a pesar de que Lactobacillus spp son las especies predominantes en la vagina de las MER, los CGP son los primeros en aparecer en las BP. En cuanto a la actividad del HE las observaciones sugieren que puede funcionar como promotor o inhibidor de las BP vaginales de acuerdo con la etapa del proceso y la patología infecciosa y es un factor a considerar para propósitos terapéuticos. La promoción de las BP de Candida spp tanto en la CVV como en los controles por parte del HE, sugiere que este podría inducir alguna alteración en los sitios receptores celulares para el FCZ. 
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Trabajo publicado en la Prensa Medica Argentina Actividad de anidulafungina (ANF) frente a biopelículas de Candida spp urogenitales: ¿una solución a futuro?Marques M, Villanueva R, Farinati A. Cátedra de Microbiología y Parasitología, Cátedra Extracurricular de Biopelículas, Facultad de Medicina Universidad del Salvador
Resumen: Las candidiasis vulvovaginales recurrentes (CVVR) o complicadas constituyen un verdadero desafío para el tratamiento antimicótico (AM). ANF es una nueva equinocandina con potente actividad frente a Candida spp y hay poca experiencia en su uso en infecciones mucosas del tracto genital provocads por biopelículas de Candida spp, Objetivo: evaluar la actividad de ANF utilizada en concentraciones CIM y Sub-CIM sobre biopelículas de Candida spp en infecciones urogenitales (IUG)in vitro. Material y métodos: estudiamos 46 aislamientos clínicos de IUG.Se distribuyeron de la siguiente manera:  24 C.albicans (CA) y 22 especies de Candida no albicans (CNA). La CIM para las células planctónicas de todos los aislamientos fue determinada por microdilución en caldo y E-test (CLSI M27-A3 y M38-A2). Para estudiar la actividad de la ANF en la primera fase de la formación de las BP (adsorción) usamos 14 aislamientos con  0.015 ug/ml (concentración CIM, grupo A) y 6 con 0.03 μg/ml ( Sub-CIM , grupo B) mediante los dispositivos de vidrio y microplacas con 96 pocillos , según métodos descritos previamente. Resultados: la CIM de ANF frente a todos los aislamientos fue de1.0 μg/ml, pero frente a Candida albicans   la CIM 90 fue de 0.03 μg/ml. Adherencia: fue mínima pero se observó exopolisacárido y poca alteración de los blastosporos en el grupo B. En el grupo A la alteración de los blastoporos fue mayor y se observó lisis En las microplacas se apreció una reducción de la absorbancia del 50% en el grupo B  y cerca del 90% en el grupo A. Conclusiones: ANF fue activa en células planctónicas y en la adherencia de la totalidad de Candida spp UG estudiadas, tanto en concentración CIM como Sub-CIM. La alteración de de las BP fue más significativa en en C.albicans. La investigación acerca del uso local de ANF en candidiasis UG severa o complicada debida a CA o CNA debe ser considerada

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Palabras claves: 

Candida spp

biopelículas

levaduras planctónicas

antifúngicos