Para esto el semen de carnero, obtenido por vagina artificial, es procesado en fresco traspolando en forma exacta lo publicado, para la especie porcina, por el grupo de trabajo de de la Universidades de La Sapienza y Bologna ⁽¹⁾, tomando en cuenta a su vez las observaciones realizadas por investigadores de otros grupos, como es el caso de Pereyra Bonnet y colaboradores ⁽²⁾ de Argentina; estos investigadores trabajando con semen ovino y de otras especies, encontraron diferencias con el grupo italiano. En particular respecto del manejo del semen previo a la co-incubación con la construcción de DNA; mostraron diferencias de trato y resultados no compatibles con lo enunciado por el grupo italiano.

 En vista de estas diferencias y basados en lo experimentado por el grupo argentino, concluimos que en necesario atender mas en detalle lo que está suficientemente establecido como básico para el éxito de la transfección plasmídica a un embrión usando el espermatozoide como vector, esto es: que el transgen, previo a la fertilización, ya sea por IA o por FIV, debe ingresar dentro del núcleo de la gameta masculina ⁽¹⁾. Este proceso denominado de "internalización"  ocurre, según se ha definido, en tres fases moleculares que incluyen receptores específicos de membrana (DNA binding protein 30-35KD), factor mayor de histocompatibilidad (MHC Class II) y molécula CD4 ⁽¹⁾. A su vez lo hace en grado variable en cada célula/donante. Su variabilidad depende de diferentes factores, siendo en el mejor de los casos en un 90% de las células. Por otro lado la localización del mismo en el núcleo de cada célula espermática resulta solo de un 20 a un 30% del total del plásmido adsorbido. El resto  del eDNA lo hace  adherido a  la membrana plasmática, distribuido de la siguiente manera: acrosoma 15%, zona ecuatorial 40%, zona sub-ecuatorial 10 %, segmento caudal de la cabeza 10%.

 También se ha señalado que ⁽¹⁾ la respuesta a la co-incubación con plásmidos de 6,5 kb es variable con diferentes individuos donantes de esperma, la que además debiera ser realizada en determinadas condiciones físico-químicas (temperatura, concentración, etc.) que permitan la permeación del eDNA al interior de la célula espermática. Si estos dos parámetros fundamentales no son tenidos en cuenta ocurre, según estos autores, que el plásmido, será transportado a la gameta femenina y luego al embrión subsecuente, en la zona ecuatorial del SPZ o en los otros lugares definidos y no en el núcleo. Esto producirá una integración disminuida y parcial del eDNA en el embrión.  Así cuando ocurra la fecundación y mas luego la fusión de los pro-núcleos el gen de interés no se integrará correctamente al genoma consecuente, queda remanente como episomal y/o ocurre el denominado mosaicismo (integración irregular). Ninguna de estas dos integraciones producirán expresión del transgen en todos los tejidos del organismo del adulto transgénico logrado y menos aún su segregación a las generaciones sucesivas.

  Por estos motivos, considerados de primordial relevancia, sometimos previamente los donantes de esperma a un estudio de calidad seminal siguiendo los parámetros zootécnicos recomendados por los investigadores que han reportado éxito con la técnica. Este trabajo fue motivo de publicación en el congreso de la SBTE ⁽³⁾. De los seis donantes evaluados fueron elegidos dos. El semen una vez obtenido y antes de ser co-incubado, debe manipularse cuidadosamente en el laboratorio para evitar cambios que puedan interferir en la reacción plásmido-membrana vital en el momento de su internalización. Esta operación supone condiciones de medio ambiente, pH, temperatura y osmolaridad óptimas, que están establecidas como ideales para la especie porcina ⁽¹⁾. Replicamos, en un principio, este trato, en la suposición que la especie ovina podría tener los mismos requerimientos. No obstante establecimos varias estrategias para identificar la respuesta adecuada en esta especie; en primer lugar, introducimos variables en las condiciones físico-químicas del acondicionamiento del espermatozoide, en segundo lugar evaluamos el comportamiento de esperma de otras especies, incluida la porcina, para el mismo procedimiento. A su vez y gracias a la atención de investigadores del IByME de la actividad privada estamos probando diferentes construcciones plasmídicas, en diferentes concentraciones.

 El espermatozoide porcino, según se ha publicado ⁽¹⁾, incorpora en el núcleo una construcción de 6,8 kb en diferente grado dependiendo de la concentración del mismo, la temperatura y el tiempo de incubación durante un determinado período de co-incubación. Para evaluar esto estamos realizando co-incubaciones a concentración, temperatura y tiempo variables en vistas a encontrar las más condiciones adecuadas para la especie en estudio y el medio propuesto.

El estudio de la localización en el interior de la célula espermática de las sondas (construcciones plasmídicas) luego de la incubación es un paso ineludible que significa nuevos desafíos. En primer lugar el espermatozoide no cuenta con estructuras moleculares suficientes en el citoplasma como para expresar un transgen que produzca fluorescencia con la construcción que utilizamos, pEGFP-N1 (Clontech) cedida por la Dra. Schilacci del IByME. Su identificación/localización debe hacerse por otros métodos. Se ha propuesto ⁽¹⁾ la utilización de centellograma y autoradiografia en base a el etiquetado del transgen con ³H. Dado que, en los primeros ensayos no fue posible visualizar localización interna de la construcción, y mas allá de las posibles causas de este hecho, en nuestro caso a etiquetamos el transgen previamente al la transfección con una construcción plasmídica de 2.7 kb de doble cadena circular, (aportada por la actividad privada) herramienta que tiene la potencialidad  de ligar con eDNA marcándolo con fluoresceína una vez dentro de la célula blanco.  Esto nos permite visualización de su localización observado bajo microscopia de luz UV y confocal para de esa manera evaluar el porcentual de su distribución en las estructuras celulares. En términos de ajustar posibles diferencias las observaciones se hacen en espermatozoides con y sin reacción acrosomal inducida.

  Durante el curso del trabajo cinco alumnos de quinto y sexto año realizaron Practica Final Orientada, tres graduados alumnos desarrollaron su Trabajo Final. Estos alumnos participaron de seminarios, talleres y  cursos de post-grado en la cátedra y en el IByME.

Referencias

  1.- Lavitrano M., Forni M., Bacci M.L., Di Stefano C., Varzi V., Wang H., Seren E. (2003) Sperm mediated gene transfer in pig: election of donnor boar and optimization of DNA uptake. Mol.Reprod.Dev. 2003Mar: 284-91.

 2.- Pereyra-Bonnet, F.; Bevacqua, R.; y otros. (2011) "Efficiency of Sperm Mediated Gene Transfer in the Ovine by laparoscopic Insemination, In-Vitro Fertilization and ICSI". Journal of Reproduction and Development 57(2):188-96 

 3.-DíazPumará, P.Z.; Rafaelli, P.M.; y otros (2010) "Sperm Mediated Gene Transfer in Sheep, Selecting Rams as Semen Donors". Acta et Scientiae Veterinariae, vol. 38 (supl 2) pag. 800