Las producciones de búfalo, ñandú, choique, emú, guanaco, llama y ciervo han comenzado a consolidar espacios que apuestan a potenciar la oferta de productos de alta calidad que la Argentina puede ofrecer al mundo.  Debido a esto, los sistemas de producción han evolucionado a sistemas mixtos, en donde especies de producción alternativa conviven en un mismo hábitat con los bovinos. Particularmente en el caso del búfalo, se ha demostrado que esta especie es susceptible a infecciones tantos bacteria (Guanziroli S, 2006; Martines D, 2006) como virales. Dentro de las virales, De Carlo y col. en el 2004 reactivaron herpesvirus por inmunosupresión en búfalos del sur de Italia. En india un estudio arrojó una seroprevalencia del 52.5% contra BoHV-1 en búfalos (Renukaradhya GJ, 1996). También se aisló PI3 de búfalos africanos (Hablim C, 1980) y se detectó BVDV en fetos de búfalos abortados del sur de Italia (Martuchello A, 2009).  

Ya se ha demostrado la circulación de diferentes agentes virales en búfalos de otras partes del mundo por lo que es de fundamental importancia establecer la identidad de los distintos agentes que circulan en los búfalos de agua de nuestro país. En este contexto es importante evaluar la sanidad de éstos nuevos sistemas mixtos de producción, caracterizar los virus circulantes  y determinar el rol del búfalo como reservorio de infecciones endémicas de los bovinos.

HIPÓTESIS

 El búfalo de agua (Bubalus bubalis sp.) es susceptible a virus respiratorios y actúa como reservorio de virus endémicos respiratorios de importancia económica en la producción bovina.

 OBJETIVOS

 General

 Evaluar la circulación de virus respiratorios de importancia económica para la producción bovina en búfalos de agua (Bubalus bubalis sp.) mediante serología y aislamiento viral.

 Particulares

 a)    Determinar la seroprevalencia de los virus en estudio en bovinos y búfalos de agua.

 b)    Detección de virus en muestras de bovinos y búfalos.

 c)     Caracterización y comparación de los aislamientos virales Argentinos circulando en el rodeo bovino con los circulantes en el rodeo bubalino y con los circulantes en el mundo.

 ACTIVIDADES A DESARROLLAR

a)    Planificación y ejecución de muestreos en distintas regiones del país

b)    Estandarización de técnicas serológicas y de biología molecular para determinaciones de virus respiratorios en muestras de búfalos y bovinos.

c)     Evaluación de las muestras:

o    Determinación serológica

o    Detección de virus 

d)    Caracterización y comparación de los agentes virales respiratorios en ambos rodeos argentinos y con los circulantes en el mundo.

Acciones realizadas hasta el momento

RESULTADOS

Se sabe que Argentina es endémica para la Diarrea viral bovina (BVDV), Parainfluenza virus 3 (PI3), herpesvirus (BoHV) y Virus sincicial respiratorio (BRSV), sin embargo no se conoce la circulación actual de tipos, subtipos o genotipos de éstos virus en bufalos 

a) Planificación y ejecución de muestreos en distintas regiones del país.

Toma de muestra

Se trabajó con búfalos de agua y bovinos de centros de cría y reproducción del Noreste del país. Todos los procedimientos se realizaron bajo normas de Bienestar Animal, establecidas en "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", 1996  y la guía para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación de INTA. Se trabajó con poblaciones bajo el supuesto de normalidad. Se eligieron aquellas que superan los 30 individuos para poder muestrear al menos 30 siguiendo un muestreo probabilístico aleatorio simple.  Otro método utilizado fue el no probabilístico en aquellos casos que observamos una población con un grupo de individuos con signología respiratoria y genital propia de los virus en estudio. En este caso se muestreó solo ese grupo de individuos para evaluar tanto serología como circulación viral.

Obtención de las muestras 

·          Sangre entera y suero para diagnóstico serológico.

  o    Las muestras de sangre fueron obtenidas de la vena yugular utilizando agujas 18G x ½" y jeringas de 10 a 20ml. Tras la coagulación se separaron los sueros y luego fueron conservada -20° C.

·          Obtención de secreciones para aislamiento viral

o    Se tomaron hisopados de secreciones de las mucosa nasal/ocular/genital. Luego los hisopados fueron colocados en tubos conteniendo medio de transporte MEM-E suplementado con penicilina 5000 UI/ml, estreptomicina 2500 mg/ml y anfotericina B 10 mg/ml. Las muestras fueron conservadas a - 196° C (N2 líquido) hasta su utilización.

·          Obtención de tejidos para aislamiento

  o    Necropsia: Para especificar los aislamientos de los virus respiratorios de aquellos animales infectados se realizó la necropsia de estos, tanto caídos naturalmente como los sacrificados en forma experimental; a éstos se le tomaron muestras de los siguientes tejidos: mucosa nasal, orofaríngea, olfatoria, traqueal, glándula parótida, tonsila, pulmón, hígado, bazo, riñón, bulbo olfatorio y ganglio trigémino; para aislamiento viral, detección de antígenos virales (IH y IF) y extracción de ADN para detección genómica del virus en tejidos. Los tejidos fueron envueltos en aluminio conservados en N2 líquido hasta su depósito en freezer de -80 º C y fijados e incluidos en parafina. Estos procedimientos se realizaron bajo las normas de bienestar animal.

 a)    Estandarización de técnicas serológicas y de biología molecular para determinaciones de virus respiratorios en muestras de búfalos y bovinos.

 Estandarización ELISA para evaluar anticuerpos contra PI3

 Virus y Células

Las cepas virales utilizadas para generar el antígeno para el ELISA son genotipo C, genotipo B y genotipo A.  Todas las cepas fueron propagadas en la línea celular de riñón bovino Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) a 37^oC, 5 % CO₂. Se utilizó como medio de mantenimiento medio de cultivo mínimo esencial de Eagle (MEM-E, Gibco), suplementado con 2 % de suero fetal bovino (SFB) (Gibco).

Purificación viral para antígeno

Las células MDBK infectadas con los distintos genotipos fueron lisadas mediante 3 ciclos de congelación y descongelación. Después de una centrifugación inicial a 3000g durante 15 minutos, se añadieron a los lisados celulares polietilenglicol 8000 (Sigma) 10% (W/v, concentración final). Se incubó durante 4 horas a 4ºC. El virus se sedimentó a 12000g durante 60 minutos a 4ºC. El pellet se resuspendió en 2.5 ml de buffer NET y 2.5 ml de Glicerol. Finalmente se fraccionó el antígeno y se conservó a -20ºC.

Desarrollo de ELISA captura para titular antígeno

Se ensayó la técnica de Enzimo Inmuno Ensayo utilizando como captura los sueros de cobayo específico contra cada uno de los tres genotipos previamente obtenidos.

Las placas Immulon IB fueron sensibilizadas con 50 μl de una dilución (1:50) de sueros de cobayo específico contra cada uno de los tres genotipos de PI3 en buffer carbonato-bicarbonato pH 9,6. Se incubaron durante 24 horas a 4°C, luego se lavaron tres veces con PBS-T. Todos los lavados se realizaron con el mismo buffer.

El bloqueo se efectuó con 50 μl de PBS-T OVA 1% durante 1/2 hora a 37°C  con agitación constante. Se efectuaron tres lavados, se agregaron los antígenos de cada uno de los tres genotipos del virus respectivamente en 8 diluciones en base 4 comenzando con (1:10) en buffer PBS-T OVA 1%. La placas se lavaron tres veces nuevamente y se incubaron con suero bovino positivo en una dilución (1:40) en PBS-T OVA 1% durante 1 hora a 37°C con agitación. Se efectuaron tres lavados sucesivos y posteriormente se agregó un anticuerpo anti bovino, conjugado con peroxidasa (KPL) en una dilución (1:2000) durante una hora.

Se procedió al revelado utilizando agua destilada, peróxido de hidrógeno (3% p/v H2O2) y el cromógeno  ortofenilendiamina (OPD) (Sigma). Luego de 10 minutos la reacción fue frenada agregando ácido sulfúrico (H2SO4 2,5 M). La absorbancia se midió a 490nm (A490) en un lector de ELISA (Multiskan FC, Thermo Scientific).

ELISA indirecto para evaluar sueros bovinos

Se testearon para estandarizar el ELISA indirecto 5 sueros de diferentes campos, un suero positivo y un suero negativo a PI3.

Se sensibilizaron 3 placas (una para cada genotipo) Immulon IB (Dynatech, Laboratories) sensibilizando en columnas alternadas el antígeno positivo (PI3) y el antígeno negativo (restos celulares). Se incubaron durante 24 horas a 4°C, luego se lavaron tres veces con buffer fosfato salino (PBS) 1X conteniendo Tween 20 al 0,05% v/v (Promega) (PBS-T), pH 7,4. Todos los lavados se realizaron con el mismo buffer. El bloqueo se efectuó con 50 μl de buffer PBS-T ovoalbúmina 1% p/v (PBS-T OVA 1%) durante 1/2 hora a 37°C con agitación constante. Se efectuaron tres lavados y se agregaron los sueros. Tanto los sueros problema como los controles se utilizaron en 6 diluciones en base 4 comenzando con la dilución (1:40), en PBS-T OVA 1 % y se incubaron 1 hora a 37°C con agitación. Se efectuaron tres lavados sucesivos y se agregó un anticuerpo anti bovino conjugado con peroxidasa (HRP, horse radish peroxidase - Kirkegaard & Perry Laboratories, KPL) en una dilución (1:2000). Se procedió al revelado utilizando agua destilada, peróxido de hidrógeno (3% p/v H2O2) y el cromógeno orto-fenildiamina 0,06 mg/ml (OPD) (Sigma). Luego de 10 minutos la reacción fue frenada agregando ácido sulfúrico (H2SO4 2,5 M). La absorbancia se midió a 490nm (A490) en un lector de ELISA (Multiskan FC, Thermo Scientific).

Debido a que algunos sueros presentaron diferencia en los títulos de anticuerpos dependiendo del antígeno utilizado y no de la concentración del mismo se decidió utilizar para sensibilizar las placas una mezcla de los tres genotipos virales con una misma concentración de cada uno de ellos.

Estandarización técnicas moleculares para caracterizar virus PI3

Para la caracterización genómica de los virus RNA se utilizaron las siguientes técnicas:

Extracción de ARN viral 

Las células MDBK infectadas con los aislamientos fueron lisadas mediante tres ciclos de congelación y descongelación. Después de una centrifugación inicial a 3.000 g durante 15 min, se añadieron a los lisados celulares polietilen glicol 8000 (Sigma), 10% (w / v, concentración final), sé incubó durante 4 horas a 4 ° C. El virus se sedimentó a 12.000 g durante 60 min a 4 ° C. El ARN total se extrajo utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen) según las indicaciones del fabricante.

Retrotranscripción-PCR (RT-PCR)

Para la reacción de transcripción reversa (RT), 0,3 µg de oligonucleotidos específicos (0,5 µg/µl) fueron incubados con 7 ml de ARN. Luego se agregó el buffer 5X de la enzima M-MLVRT, dNTPs (5mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 40 unidades (U) de RNA sin y 200 U de M-MLVRT. El volumen final de la reacción se llevó a 25 ml con H₂O libre de ARNsas, se incubó 1 hora a 42°C y luego 15 minutos a 90°C. El ADN copia (ADNc) obtenido se almacenó a -20°C hasta su utilización.

A partir del ADNc obtenido se amplificó por PCR un fragmento interno del gen codificante para la enzima gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (gen gapdh), gen celular de expresión constitutiva (control de extracción de ARN y RT). Seguidamente los RNAs positivas para el gen gapdh fueron estudiados en busca de genoma viral de BPIV3. Para ello se amplificó un fragmento de la proteína de fusión (F) (375 pb), un fragmento de la proteína de matriz (M) (328 pb) y uno de la hemoaglutinina-neuraminidasa (HN) (509 pb) para ello se diseñaron cebadores en base a una secuencia consenso entre los virus BPIV3

 b)    Evaluación de las muestras:

o    Determinación serológica

  1)    Seroneutralización: La evaluación de anticuerpos seroneutralizantes se realizó mediante la técnica de seroneutralización a virus fijo-suero variable para la detección de Ac. contra Herpes virus (Romera, 2000; Del Médico Zajac, 2006), BRSV y BVDV.

2)    ELISA: Para el caso de BoHV, se utilizó además un ELISA que detectar anticuerpos totales, desarrollado en el laboratorio (Romera, 2000, Renukaradhya, 1996) y ELISA de competición (Kit comercial).

3) Inhibición de la hemoaglutinación: ésta técnica se utilizó para la determinación de Ac contra Parainfluenza virus 3.

 Hasta el momento se tomaron 1000 muestras de suero de búfalos de distintas regiones del NEA de nuestro país.

 Los porcentajes de animales seropositivos se detallan a continuación:

Virus % positivos % negativos 

Herpesvirus 34 66

VDV 30 70

BRSV 44 56

PI3   30 70

b)    Evaluación de las muestras:

o    Detección de virus

Detección de virus en muestras de búfalos:

  En cuanto a la detección de virus se analizaron muestras de secreciones corporales de búfalos (hisopados nasales y genitales). Hemos aislado un virus parainfluenza tipo 3 de un brote clínico de enfermedad respiratoria en búfalos de un rodeo mixto  tambero (bovinos y búfalos), ubicado en la provincia de Chaco. Se aislaron partículas virales de secreciones nasales y vaginales de 2 animales de un total de 25 animales muestreados. Estos aislamientos fueron caracterizados mediante inmunofluorescencia directa e indirecta, microscopia electrónica, fueron titulados por hemoaglutinación de glóbulos rojos de cobayos y además se probó la capacidad del virus de hemoadsorber glóbulos rojos en una monocapa celular infectada.

La técnica de microscopia electrónica de transmisión reveló viriones esféricos pleomórficos de aproximadamente 50-300 nm de diámetro morfológicamente similares a paramixovirus. Se realizó una inmunofluorescencia indirecta (IFI) e inhibición de la hemoaglutinación con un suero de referencia anti - parainfluenza 3 bovino (BPIV3) que logró reconocer el aislamiento. El virus aislado fue capaz de aglutinar glóbulos rojos de cobayos (16 UHA) y hemoadsorberse a monocapas infectadas.

RELEVANCIA DEL PLAN PROPUESTO

En la gran mayoría de los casos, los búfalos comparten el hábitat con los bovinos; ésta situación no significa ausencia de dificultades para su explotación conjunta, ya que se pueden presentar cuestiones de tipo sanitarias, porque los agentes de ciertas enfermedades infecciosas pueden transmitirse entre ambas especies. Los virus endémicos respiratorios son agentes patológicos que preocupan a los productores, por el gran impacto productivo y económico que provocan sobre los índices de productividad de los rodeos y por ser además el búfalo naturalmente receptivo.

Este proyecto beneficiará directamente al sector agropecuario ya que podrá disponerse de información representativa de los agentes virales que circulan en los rodeos bubalinos argentinos; así como también evaluar el papel del búfalo como reservorio de virus endémicos de importancia económica para la producción bovina.