Investigadores

Resumen

Sadir, Ana María
Romera, Sonia Alejandra
Carrillo, Jorge Ernesto
Duffy, Sergio Jorge

El estudio del establecimiento y la reactivación de una infección latente en la caracterización de una cepa candidata para ser utilizada como vacuna en bovinos resulta indispensable para evaluar el impacto que tendría su eventual administración como vacuna viva. Para ello, los animales pertenecientes a cada grupo, infectados con los virus bajo estudio, fueron inoculados por vía endovenosa con dexametasona. Se determinó la reexcreción viral, la signología clínica asociada, la respuesta inmune y la presencia de virus y antígenos virales en los sitios asociados a la latencia. ESTUDIO DE LA LATENCIA DE BoHV-1DgEbgal EN BOVINOSContinuando con las evaluaciones de virulencia y patogenia de BoHV-1DgEbgal en el hospedador natural después de comprobar su marcada atenuación en términos de replicación y síntomas clínicos inducidos, resultó de interés evaluar si esta cepa modificada era capaz de entrar en latencia y por consecuencia reactivarse ante situaciones de estrés. El estudio de la latencia de BoHV-1DgEbgal en bovinos se abordó en primer término mediante la inducción experimental de la reactivación viral a través de un tratamiento inmunosupresor. Posteriormente, se analizaron los tejidos propuestos en la bibliografía como sitios de establecimiento de la infección latente.Con el objetivo de contar con los parámetros de excreción viral, signos clínicos y respuesta inmune asociados a la reactivación de BoHV-1 LA y la cepa BoHV-1DgEbgal, se realizó el tratamiento inmunosupresor experimental a dos animales de cada grupo a los días 48 y 74 pi.REACTIVACIÓN DE LOS ANIMALES INFECTADOS CON LA CEPA BoHV-1 LACuatro animales (N^o 22 y 21) previamente infectados con el virus BoHV-1 LA y  BoHV-1 gE- fueron inoculados durante 5 días consecutivos con dexametasona endovenosa (0,1 mg/kg) para inducir la reactivación viral. Excreción viral y sintomatología clínicaEl animal que recibió el tratamiento con dexametasona a partir del día 48 pi (Nº 22), no excretó partículas infectivas en secreciones nasales durante el período post tratamiento (pt) evaluado. Asimismo, las muestras fueron negativas al realizarse tres pasajes ciegos como al analizar la presencia de ADN viral mediante reacciones de amplificación por PCR. Respecto a la sintomatología clínica, el animal 22 no mostró signos ni presentó registros de temperatura rectal elevada.Por otro lado, el animal N^o21 que comenzó el tratamiento el día 74 pi presentó excreción viral a partir del cuarto día pt, la cual se prolongó durante 6 días y alcanzó un valor máximo de 10^6.5DICT₅₀/ml al día 5 pt (Figura 7).Los resultados de la excreción viral del animal 21 durante el período de reactivación viral, en términos de duración y valores máximos, fueron menores que los detectados durante la infección aguda, cuando excretó virus durante 9 días con un título máximo de 10^7.5DICT₅₀/ml. El animal 21 tuvo temperatura rectal mayor a 39,5^oC durante dos días consecutivos (días 9 y 10 pt). Sin embargo no presentó otros signos clínicos asociados a la enfermedad por BoHV-1 durante todo el período pt examinado.No se detectó virus infeccioso de las secreciones nasales de ninguno de los dos animales infectados con la cepa BoHV-1DgEbgal y tratados con dexametasona, aún después de realizar tres pasajes ciegos. Asimismo, las reacciones de amplificación por PCR a partir de las secreciones nasales de estos animales durante y después del tratamiento inmunosupresor fueron negativas No se observaron signos clínicos compatibles con enfermedad producida por BoHV-1 en ninguno de los dos animales durante todo el período pt examinado.Respuesta inmunePara determinar la presencia de anticuerpos anti-BoHV en suero y secreciones nasales se realizaron los ensayos de ELISA. En el animal 22 el título de anticuerpos séricos no presentó variaciones entre las muestras anteriores y posteriores al tratamiento inmunosupresor, manteniéndose en un valor de 2,2 (log₁₀). Sin embargo se observó un incremento en los anticuerpos de ambos isotipos estudiados en secreciones nasales, de 0 a 1,5 (log₁₀) en ambos casos. Para el animal 21 se verificó un aumento en el título de anticuerpos en suero después del tratamiento inmunosupresor, de 2,2 a 3,4 (log₁₀), así como incrementos en los anticuerpos de clase IgA e IgG1 en secreciones nasales, alcanzando valores de 3,3 y 3,9 (log₁₀), respectivamente Los datos de excreción viral y respuesta inmune sugieren que el animal número 21 reactivó la infección con BoHV-1 experimentalmente. Respecto al animal 22, no se detectó variación en los niveles de anticuerpos séricos ni excreción de partículas infectivas. Asimismo, el día de la necropsia se extrajo una muestra de sangre y un hisopado nasal siendo los resultados negativos. Sin embargo, se produjo un incremento en los anticuerpos en secreciones nasales entre las muestras previas y posteriores al tratamiento inmunosupresor. Por lo tanto, no podemos descartar que dicho animal haya reactivado la infección latente. Respecto de los animales previamente infectados con  BoHV-1DgEbgal no se detectaron anticuerpos de clase IgA o IgG1 en las secreciones nasales correspondientes tanto al comienzo del tratamiento inmunosupresor  como a los días posteriores al mismo.En un animal Nº 509 se verificó un aumento en el título de anticuerpos después del tratamiento inmunosupresor, de 1,6 a 2,2 (log₁₀). El otro animal (Nº 1016) no presentó variaciones en el título de anticuerpos séricos entre las muestras anteriores y posteriores al tratamiento, manteniéndose en un valor de 2,2 (log₁₀). Asimismo, los ensayos de seroneutralización fueron positivos para las muestras de sueros anteriores y posteriores al tratamiento para ambos animales.Los datos de excreción viral, signos clínicos y respuesta inmune sugieren que los animales infectados con la cepa BoHV-1DgEbgal no reactivaron la putativa infección latente. EVALUACIÓN DE LOS SITIOS DE ESTABLECIMIENTO DE LATENCIA Se estudió la distribución de antígenos y ADN viral en los tejidos propuestos como sitios de establecimiento de latencia de BoHV-1, provenientes de los animales infectados con los virus BoHV-1ΔgEβgal y BoHV-1 LA. La técnica de inmunohistoquímica a partir de órganos fijados e incluidos en parafina permitió evaluar la infección productiva que ocurre a tiempos tempranos en estos órganos, previo al establecimiento del estado de latencia. Asimismo, se estudió la presencia de genoma viral en muestras de todos los animales infectados durante las experiencias.  Detección de antígenos virales El ganglio trigémino (GT) es el sitio de latencia más importante en los alfaherpesvirus. Por ello se estudió la presencia de antígenos virales en los GT de los animales infectados con los virus BoHV-1DgEbgal y BoHV-1 LA mediante la técnica de inmunohistoquímica. En las muestras del animal infectado con la cepa BoHV-1 LA correspondientes al día 5 pi encontramos células no-neurales positivas mientras que las neuronas fueron negativas. A los 9 dpi, se observaron tanto neuronas como células no neurales con antígenos virales. Asimismo, se observó un infiltrado de células mononucleares en las muestras de GT de ambos días. Sin embargo, en el GT del animal infectado con la cepa BoHV-1DgEbgal del día 9 pi no se encontraron células reactivas. Asimismo se analizaron muestras de tonsilas de animales infectados con BoHV-1 LA o BoHV-1DgEbgal sacrificados el día 9 pi. Se encontraron células positivas en los cortes de tonsila del animal infectado con el virus BoHV-1 LA pero no en el tejido del animal infectado con la cepa BoHV-1DgEbgal.Por otra parte, en un corte de mucosa nasal del animal infectado con la cepa BoHV-1 LA y sacrificado al día 5 pi, se encontró una célula morfológicamente compatible con un cuerpo neuronal positivo a la marcación con el anticuerpo anti-BoHV-1. La detección de antígenos virales en GT y tonsila en los animales infectados con el virus BoHV-1 LA sugiere la infección de estos tejidos, de acuerdo a lo esperado para una cepa salvaje de BoHV-1. El hallazgo de una célula reactiva con morfología neuronal en la mucosa nasal del bovino eutanasiado al día 5 pi podría indicar una de las vías de acceso del virus a los sitios de latencia.Los datos de las muestras procesadas por inmunohistoquímica sugieren que la cepa BoHV-1DgEbgal no produce una infección productiva en los sitios de latencia propuestos para BoHV-1 en el bovino luego de la infección experimental por vía intranasal, al menos a la dosis utilizada en este estudio.Detección de ADN viralPara profundizar el estudio del establecimiento de latencia en estos tejidos, se investigó la presencia de ADN viral en ganglio trigémino (GT) y tonsilas (T) mediante amplificación por PCR. La extracción de ADN de las muestras se confirmó en todos los casos mediante la amplificación por PCR de un fragmento del gen celular bovino GAPDH. Todas las muestras de GT provenientes de animales infectados con la cepa BoHV-1DgEbgal fueron negativas para las reacciones de amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos específicos para BoHV-1. Sin embargo, todas las muestras de animales infectados con la cepa BoHV-1 LA fueron positivas, observándose una banda específica de 390 pb correspondiente a un fragmento del gen gC y otra banda de 281 pb de un fragmento del gen gE . La amplificación por PCR a partir de tonsilas de animales infectados la cepa BoHV-1DgEbgal y eutanasiados a los días 9 y 42 pi fue negativa, mientras que las tonsilas de los animales infectados con BoHV-1 LA sacrificados a los 9 y 42 dpi fueron positivas. En las muestras positivas se observa una banda de 354 pb correspondiente a un fragmento del gen gC . Los datos de amplificación por PCR indicarían la ausencia de ADN del virus BoHV-1DgEbgal en los sitios de latencia propuestos para BoHV-1. Por otra parte, la detección de ADN viral en las muestras de todos los animales infectados con la cepa BoHV-1 LA confirma el acceso de esta cepa al GT y tonsilas. Conjuntamente, los resultados de la experiencia de reactivación y el estudio de los GT y tonsilas sugieren que la cepa BoHV-1DgEbgal no alcanzaría estos sitios de latencia, y por ende, no establecería una infección latente. En consecuencia, la reactivación no sería posible, tal como sugieren los resultados obtenidos luego del tratamiento inmunosupresor.  En resumen, no se encontraron evidencias de que esta cepa alcance e infecte tonsilas o GT, constituyendo éste el primer reporte de una cepa replicativa de BoHV-1 que no establecería una infección latente ni reactivación/reexcreción viral. Todo esto tendría importantes implicancias en la estabilidad de esta cepa, disminuyendo los riesgos de dispersión del virus en los rodeos y de recombinación, así como reduciendo la incidencia de enfermedad respiratoria bovina.  Patente Esta cepa recombiannate fue patentada como "Cepa mutada recombinante del virus Herpes Bovino de tipo 1, Método para obtener dicha cepa, plasmido vector y vacuna". Acta N° 02 01 04305.  Presentada ante el Instituto Nacional de la Propiedad Industrial. Cepa mutada recombinante del virus herpes bovino de tipo 1, metodo para obtener dicha cepa, plasmido vector y vacuna. Registro de patente en Argentina.http://www.patentesonline.com/cepa-mutada-recombinante-del-virus-herpes-bovino-de-tipo-1-metodo-para-obtener-dicha-34679ar.html.   Registro de la vacuna Por su parte para registrar la vacuna  se realizó una última experiencia de inmunización de bovinos a campo con la cepa BoHV-1DgEbgal. La vacuna fue formulada por la empresa Biogenesis-Bago a quien se transfirió este desarrollo . Se inmunizaron 10 bovinos con la vacuna marcadora inactivada y se evaluó la inmunogenicidad en términos de respuesta inmune humoral inducida. Los animales fueron revacunados a los 21 diías post vacunación y se registraron los  niveles de anticuerpos  durante 60 días postvacunación.Se evaluaron los niveles de anticuerpos totales mediante un ELISA indirecto y los anticuerpos neutralizantes mediante seroneutralización.Ambas técnicas demostraron que la vacuna induce un buen nivel de anticuerpos con incrementos significativos después de la revacunación. A su vez se evaluó el carácter de marcadora de la vacuna mediante un ELISA comercial que permite identificar anticuerpos contra la glicoproteína E diferenciando de este modo sueros de animales vacunados de infectados. Los resultados obtenidos en esta experiencia permitieron el registro de la vacuna en su formulación monovalente inactivada.

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Palabras claves: 

Inmunología

Vacunas-marcadoras

HVB-1

Herpes

Rinotraqueítis

Glicoproteinas virales